Et instrument og metoder til udarbejdelse af nanoliter mellemstore prøve diskenheder for transmissions Elektron Mikroskopi er præsenteret. Ingen papir-blotting trin er påkrævet, således at man undgår de skadelige konsekvenser dette kan have for proteiner, betydeligt reducere prøve tab og muliggør analysen af enkelt celle lysate for visuel proteomics.
På grund af de seneste teknologiske fremskridt, kryo-elektronmikroskopi (cryo-EM) er hurtigt ved at blive en standard metode til den strukturelle analyse af proteinkomplekser til atomic opløsning. Protein isolation teknikker og prøve præparationsmetoder for EM er dog stadig en flaskehals. Et relativt lille antal (100.000 til et par millioner) af individuelle protein partikler skal være afbildet til høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel EM tilgang, at gøre miniaturized prøve håndtering teknikker og mikrofluid principper muligt.
En minituariseret, papir-blotting-gratis EM gitter forberedelse metode for prøven før conditioning, EM gitter priming og efterbehandling, der kun forbruger nanoliter-mængder af prøven er præsenteret. Metoden bruger en udlevering system med sub-nanoliter præcision kontrol flydende udbredelse og EM gitter priming, en platform til at styre den gitter temperatur derved bestemme relative luftfugtigheden over gitteret EM, og en pick-og-springet-mekanisme for prøve vitrifikation. Til cryo-EM, en EM gitter er placeret på den temperatur-kontrollerede fase og prøven er indsugning i et kapillarrør. Kapillar spidsen er placeret i nærhed af gitter overflade, gitteret er fyldt med prøven og overskydende er re indsugning i microcapillary. Efterfølgende er prøve film stabiliseret og lidt tyndet af kontrolleret vand fordampning reguleret af forskydningen af platform temperaturen i forhold til Dugpunktet. På et givent tidspunkt udløses pick og springet mekanisme, hurtigt overføre PRIMES EM gitteret til flydende Ethan for prøven vitrifikation. Alternativt findes prøve-conditioning metoder at forberede negative pletten (NS) EM nanoliter mellemstore prøve diskenheder.
Metoderne, der kraftigt reducere prøve forbrug og undgå tilgange potentielt skadelige til proteiner, såsom filtrerpapir blotting anvendes i konventionelle metoder. Derudover minuscule mængden af prøven kræves giver mulighed for nye eksperimentelle strategier, såsom hurtig prøve conditioning, kombination med én celle lysis for “visuelle proteomics” eller “lossless” samlede prøveforberedelse til kvantitativ analyse af komplekse prøver.
Hardware og software til strukturel analyse af proteinkomplekser af transmissions Elektron Mikroskopi (TEM) har massivt Avanceret i løbet af de seneste år. Forbedringerne af banet vej for en “resolution revolution”1,2 og fundamentalt ændret strukturelle forskning. Revolutionen begyndte med fremkomsten af cryo-Elektron Mikroskopi (cryo-EM)3,4, giver mulighed for forberedelse af biologiske prøver under tæt på fysiologiske tilstande samtidig reducere stråling følsomhed og forebygge prøven fordampning i det høje vakuum transmissions-elektronmikroskop5. I de følgende år øget incremental teknologiske fremskridt gradvist opløsning opnåelige. Blandt disse nyskabelser var anvendelsen af felt-emission kanoner6,7, og for nylig forbedret data analyse algoritmer, som højst sandsynligt metoder8,9. Direkte elektron detektor kameraer10,11,12,13, filmtilstand imaging og medfølgende software udvikling14,15, 16 , 17, forudsat det endelige gennembrud kræves for at opnå atomare opløsning for biologiske prøver af enkelt partikel analyse (for en anmeldelse Se Cheng, Grigorieff, et al. 18). betydningen af cryo-EM blev for nylig anerkendt ved tildelingen af Nobelprisen i kemi for tre af pionererne.
For at billedet en biologisk prøve af TEM, metoden bruges til at indlæse EM gitter med prøve (efterfølgende benævnt “gitter forberedelse”) skal sikre, at det resulterende udsnit lag (i) er tynd nok (< 100 nm) at undgå omfattende støj af uelastisk eller formere sig spredt elektroner, (ii) tåler den høje tomrum af elektron mikroskop, og (iii) beskytter biomolekyler mod strålingsskader. To vigtigste metoder der anvendes til at opfylde disse Sportel: Negative pletten(NS)19,20 procedurer (fig. 1A) adsorberes prøven til en tynd carbon film, integrere biomolekyler i amorfe heavy metal og derefter Tillad forsamlingen til at tørre i luften. Dette er enkel og hurtig, og de indlæste EM gitre (efterfølgende benævnt “prøve gitre”) er let at gemme og kan opbevares i længere tid (normalt år). I TEM, forberedelserne udviser stor kontrast på grund af NS og tolererer højere elektron doser end cryo-præparater, men beslutningen er begrænset til ca. 20 Å. Cryo-EM procedurer (fig. 1B) ansætte holey carbon understøtter. En tynd film af prøveopløsningen er strakte sig tværs over hullerne og gitteret EM er kastet ud i en cryogen, normalt flydende Ethan, hurtigt afkøles det under-150 ° C. Resultatet er en amorf, forglasset, 50 til 100 nm-tyk film af løsningen i støtte huller. Denne tynde, amorfe film tåler høje vakuum i elektron mikroskop og, i det ideelle tilfælde bevarer biologiske strukturer i deres hjemstat. Proceduren giver mulighed for biologiske prøver at blive afbildet på høj opløsning. Dog skal gitteret prøven opbevares ved temperaturer nedenfor-150 ° C på alle tidspunkter for at undgå devitrification. Det kan være afbildet med forholdsvis høj elektron doser på grund af den lave temperatur, men kontrasten og signal / støj-forhold er imidlertid lavt. Derfor gennemsnit teknikker er ansat til at øge kontrasten, og forudsat at stikprøven er afbildet fra forskellige vinkler, en høj opløsning tredimensional (3D) kort kan rekonstrueres. De mest almindeligt anvendte og meget vellykket metode til 3D rekonstruktion allerede nu er metoden med enkelt partikel. En nylig gennemgang, finder Cheng på al.18.
Negative pletten TEM (NS-EM) er vigtigt for screening og kvalitetskontrol, når høj kontrast er nødvendig, eller når kun begrænsede mængder af prøven er tilgængelige (adsorption til carbon film generelt koncentrerer prøven). Enkelt partikel cryo-EM er guld-standard metode hvis høj opløsning 3D rekonstruktioner af protein struktur er rettet til.
Figur 1: principper af TEM gitter forberedelse og sammenligning mellem klassisk (panelet A, B) og en mikrofluid tilgang (panel C, D). A) klassisk NS-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted i hånden på en EM gitter dækket med en kontinuerlig carbon film (efterfølgende benævnt en ‘NS-EM grid’) (i). Efter inkubation i ca. 10 s, filtrerpapir bruges til at skamplet væk den overskydende væske fra side (ii), forlader den adsorberede biomolekyler i en tynd vand film. Efterfølgende, proteinet er inkuberes i en heavy metal saltopløsning, f.eks., 2% uranyl acetat, for 20 s (iii), og igen væsken fjernes ved at duppe fra side ved hjælp af filtrerpapir (iv). Endelig, EM-grid er overladt til tørre i luften. B) klassisk cryo-EM gitter forberedelse: om 3 µL af prøven er pipetted af en hånd på en film fra holey kulstof. For at danne en tynd sample film, fjernes den overskydende væske ved papir-duppe ansigtet-på fra én eller begge sider (ii). Endelig er nettet hurtigt kastet ud i flydende Ethan for forglasning (iii). C) NS-EM gitter forberedelse ved hjælp af opsætningen af cryoWriter: A 5 nL volumen er indsugning fra prøve lager ved hjælp af en microcapillary, (i). For eksempel conditioning, er microcapillary spidsen nedsænket i conditioning løsning, fx2% ammoniumacetat. Ioner og små molekyler der udveksles ved diffusion (ii). Bemærk, at dimensionerne af microcapillary sikre, at hele processen er diffusion drevet. Proteiner har meget lavere diffusion konstanter end salt ioner og er ikke betydeligt tabt24. Endelig er prøven udleveres på nettet og lov til at tørre (iii). D) principper af cryo-EM gitter forberedelse ved hjælp af cryoWriter-baseret metode: en EM gitter dækket med en holey carbon film er placeret på overfladen af en temperatur-kontrollerede platform og besiddelse af pincet. Platformen er Temperaturstyret ved en forskydning fra dugpunkt temperatur af nettet miljøet. Gitteret er flyttet i forhold til den microcapillary, der indeholder prøven og microcapillary sænkes, indtil det er nogle få mikrometer over nettet. Efterfølgende, er et par nanoliters af prøven udleveret fra det mens scenen er flyttet i en spiral mønster; overskydende væske er re indsugning (i). Efter EM gitter grunding, microcapillary er trukket tilbage og gitteret forbliver på den temperatur kontrollerede platform (efterfølgende benævnt dugpunkt (DP) fase) for en kort tid at give en kontrolleret mængde af prøven til at fordampe. For springet frysning, er gitteret hurtigt trukket tilbage fra scenen med pincet (ii), vendt 90 ° til lodret position og kastet ud i en cryogen bad (iii) (efterfølgende benævnt ‘pick-og-springet’ mekanisme). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Desværre, forbedret gitter forberedelse metoderne til NS og cryo-EM har ikke væsentligt, siden de blev opfundet. Nuværende ulemper er høj sample forbrug (ca. 3 µL af protein, 1 mg/mL) og den store mængde (> 99%) af prøven mistede (figur 1A, B). Desuden, den klassiske metode bruges til at forberede cryo-EM gitre er en barsk procedure for proteiner: først, det indebærer en omfattende ansigt-på papiret-blotting trin (figur 1B, ii), og det andet protein er udsat for luft-vand-grænseflade for en betydelig mængde tid21. Her, en alternativ metode til prøven forudgående konditionering, prøve gitter forberedelse og efterbehandling (gitter tørring eller vitrifikation) for NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (fig. 1D) er præsenteret. Den in-house bygget setup, kaldet “cryoWriter”, bruger miniaturized prøve håndtering teknologi og mikrofluid principper Aspirér, tilstand og give afkald på prøve, undgå papir blotting helt og at give alternative metoder til tynde prøver for Cryo-EM. Det betydeligt reducerer forbruget af prøven og forbedrer bruger-kontrol over prøveforberedelse som helhed. Desuden metoden giver mulighed for nye eksperimentelle programmer; forberedelse af isolerede biologiske komponenter af individuelle celler i en tilgang, kaldet “enkelt celle visuelle proteomics”22,23,24,25.
‘CryoWriter’ instrument og de protokoller, der kræves for at forberede prøve gitre for NS – og cryo-EM fra nL størrelse samlede stikprøve diskenheder og helt undgå den klassiske papir-blotting trin præsenteres. Mikrofluid principper og et micromechanical system er kombineret i cryoWriter at gøre dette muligt.
Vores erfaring viser, at når de miniaturized metoder præsenteres i dette håndskrift er anvendt, parameter plads til EM-grid forberedelse er større end for klassiske metoder og under strammere brugerkontrol. Vigtigere, gør øget reproducerbarhed opnåede det muligt at pre-skærm med prøven buffersystem, suppleret med en let tilgængelige test protein til at bestemme de optimale parametre, før den faktiske eksperiment udføres. Dette holder forbruget af stikprøven af interesse til et absolut minimum og kan varmt anbefales. Kritiske trin for både NS og cryo EM gitter forberedelse er: (i) Priming pump system; for sub-nanoliter volumen udlevering, skal systemet væske (vand) være afgassede og boble gratis. (ii) præcis kontrol af glød decharge eller plasma rengøring skridt; gitteret EM overflade egenskaber er afgørende for reproducerbare resultater. (iii) stikprøve conditioning; den tid, der kræves til konditionering, fxmed NS, afhænger på buffer type, salt indhold og koncentration (figur 3), samt på dysen geometri microcapillary24. (iv) fordampning satser for NS-EM forberedelserne til kvantitative EM; kaffe-ring virkning kan forbyde kvantitativ analyse af NS-EM præparater, og skal blive undertrykt ved langsom fordampning satser kontrolleret af DP-scenen.
Forskellige aspekter af præparationsmetoder præsenteres gitter kan kombineres frit, så udviklingen af alsidig protokoller for særlige prøver. Typiske eksempler ville være fjernelse af et stof, der forhindrer høj opløsning EM, fx, glycerol, af en conditioning skridt før gitter forberedelse til cryo-EM; indførelsen af mægleren molekyler, såsom ligander, af conditioning før gitrene tilberedes; eller undersøgelse af enkelt celle lysate af NS – eller cryo-EM (figur 6).
Brugen af mikrofluidik og minimal prøve beløbene i de præsenterede metoder fjerner helt behovet for papir-blotting trin. Dette er en stor fordel, fordi papir blotting er en barsk behandling for proteiner, potentielt forurenende prøve med uønskede ioner og i sagens natur fører til massive prøve tab. På den anden side undgås effekter potentielt forårsaget af grænsefladen luft-vand af tynde prøve filmen dannes når cryo-EM prøver er forberedt på den klassiske måde ikke når cryoWriter der bruges. Grid egnet til cryo-EM kan være forberedt med en mindre end 0,2 s ventetiden mellem eksempelprogrammet og vitrifikation (data ikke vist). Men som proteiner rejser et par tiendedele af et nanometer i et par nanosekunder ved diffusion, der er stadig nok tid for dem til at kollidere med luft-vand-interface af en 100 nm tykke sample film flere gange. Men mængden af proteiner stikning til grænsefladen luft-vand kan reduceres væsentligt ved at fugerne kort tid og kan forhindre protein denaturering eller begrænset partikel orientering. En anden lovende tilgang, der kan beskytte følsomme proteiner fra grænsefladen luft-vand er til at dække sample film af lavmolekylære overfladeaktive stoffer. Disse forbindelser kan indføres hurtigt af en conditioning skridt i cryoWriter før gitter forberedelse. Høj overflade-til-volumen forholdet mellem mikrofluid systemer er en yderligere begrænsning af cryoWriter, som prøven kan potentielt være tabt af uspecifik adsorption til microcapillary overflade og forstyrre kvantitativ analyse af partikel tælling. Problemet er behandlet på to måder: først, prøven ikke rejse lange afstande inden for microcapillary. Faktisk forbliver nanoliter sample volumen på kapillær spidsen under hele behandlingen. Andet overflade til volumen-forholdet reduceres yderligere ved hjælp af microcapillaries med relativt stort indre diameter, fx, 180 µm. for det tredje, overflader på microcapillaries kan let passivated, om nødvendigt, fxved at behandle dem med kommercielt tilgængelige polylysine ethanol glykoler (PLL-PIND).
Høj opløsning analyse af proteiner af enkelt partikel tilgang anvendes i EM kræver kun 100.000 til et par millioner billeder af individuelle protein partikler. Dette betyder, at mikrofluid teknikker kan give nok proteinkomplekser for den strukturelle undersøgelse. En minituariseret immuno-nedbør metode til hurtig isolering af proteinkomplekser (omkring 1 time) fra minimal celle beløb (ca. 40.000 celler) blev udviklet tidligere28. Denne metode vil nu være direkte knyttet til miniaturized prøve forberedelsen af cryoWriter. Det endelige mål er at udvikle en integreret mikrofluid pipeline for ultra-hurtig protein isolation og cryo-EM gitter forberedelse, der kræver mindre end to timer i alt. Desuden, som det fremgår af figur 6, minut mængde og mængden af materiale til forberedelse af prøver og næsten tabsfri conditioning og gitter forberedelse procedure opnås ved hjælp af cryoWriter, gøre det muligt at studere proteinet komplekser af individuelle celler. Sammen, lægge metoden miniaturized immuno-nedbør og cryoWriter fundamentet for en ny proteomics metode kaldet “enkelt celle visuelle proteomics”, som vi for nylig demonstreret for heat-shock eksperimenter24. Data analyse algoritmer gearet til analyse af “visual proteomics” billeder er i øjeblikket ved at blive testet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne vil gerne takke workshop af Biozentrum af Universitet Basel for deres støtte, S. A. Müller for kritiske diskussioner og nøje læsning af manuskript, A. Fecteau-LeFebvre for teknisk bistand med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann for membran protein teste prøver (alt fra C-CINA, Biozentrum, universitetet i Basel) og A. Engel, emeritus Universitet Basel for sin inspirerende samtaler. Prøver var venligst leveret af P. Ringler, M.-A. Mahi, og T. Schwede (Biozentrum, universitetet i Basel), P. Leiman (laboratorium for strukturel biologi og Biofysik, EPFL) og R. Diaz-Avalos (New York strukturel biologi Center, USA). Projektet blev støttet af den schweiziske Nanoscience Institut (SNI, projekt P1401, ARGOVIA projekt MiPIS) og den schweiziske National Science Foundation (SNF, projekt 200021_162521).
Liquid handling | |||
Microcapillary tip | New Objective | FS360-100-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20 |
FS360-150-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20 | ||
Conductive sleeve | New Objective | CONGAS-1 | Conductive Elastomer for HV contact, 12" long |
Fused silica tubing | BGB-Analytik | TSP-150375 | TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter |
PressFit Connector | BGB-Analytik | 2525LD | Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 |
Syringe 10 µl | BGB-Analytik | HA-80001 | Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included) |
Syringe pump controller | Cetoni | A3921000093 | neMESYS controller |
Syringe pump dosing unit | Cetoni | A3921000095 | neMESYS dosing unit |
Temperature control | |||
Dew point sensor | Meltec | UFT75-AT | Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL |
Temperature sensor | Sensorshop24.ch | LS7-PT1000-1.0-3L | Surface mountable temperature sensor Pt1000 |
Peltier controller | Cooltronic | TC2812 | PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output |
Peltier element | Distrelec.ch | PE-127-14-15-S | 40×40 mm |
Water-cooling block | – | – | Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base |
Water pump | Digitec.ch | 294877 | XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4 |
Water heat exchanger block | – | – | Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water |
Small water coolers | PCHC.ch | 223050 | Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs |
Small peltier elements | Distrelec.ch | PE-031-10-15-S | Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs |
Mechanics | |||
Linear stage z-axis | Dyneos AG | M-404.2PD | High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor |
Stage controller | Dyneos AG | C-863 | Mercury Servo Controller |
Microscope xy-axis stage | Prior Scientific | H117EIL5 | Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope |
Small permanent magnets | Supermagnete | S-05-08-N | Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10 |
Small electromagnet | Schramme | EG1025A02/110 | Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W |
Controller electromagnet | Conrad.ch | MST-1630.001 7 | Electromagnet control PCB board |
Solenoid hub | Distrelec.ch | HD8286-R-F-24V100% | Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W |
Mini tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0302-M5S-PS | Dumont Type 5 mini, super thin tips |
Various optomechanical parts | Thorlabs | – | – |
Various mechanical parts | Workshop Biozentrum, University Basel | – | Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files |
Optics | |||
Laser diode | Thorlabs | CPS780S | 780 nm laser diode module 2.5 mW |
Photo detector | Thorlabs | PDA100A-EC | Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2 |
EM grids | |||
DURASIN FILM TEM | emsdiasum.com | DTF-03523 | 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5 |
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Buffers / Neg. stain | |||
PBS | Sigma | D8537 SIGMA | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline |
NanoVan 2% | nanoprobes.com | Negative stain vanadium based | |
NanoW 2% | nanoprobes.com | Negative stain tungsten based | |
Software | |||
openBEB | The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable | ||
CryoWriter control software (openBEB plugin) | Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply. |