Et instrument og metoder for utarbeidelsen av nanoliter størrelse utvalg volumer for overføring elektronmikroskop presenteres. Ingen papir-blotting trinn er nødvendig, og dermed unngår de ødeleggende konsekvensene dette kan ha for proteiner, betydelig redusere utvalget tap og aktivere analyse av enkelt celle lysate for visuell Proteomikk.
På grunn av teknologiske framskritt, cryo-elektronmikroskop (cryo-EM) er raskt å bli en standard metode for strukturell analyse av protein komplekser å Atom løsning. Men forbli protein isolasjon teknikker og prøve forberedelse metoder for EM en flaskehals. Et relativt lite antall (100.000 noen millioner) personlige protein partikler skal avbildes for høyoppløselig analyse av proteiner av én partikkel EM tilnærming, gjør miniatyriserte eksempel teknikker og microfluidic prinsipper mulig.
En miniatyriserte, blotting-papirløse EM rutenettet forberedelse metode for eksempel før condition, EM rutenettet grunning og etterbehandling som bare bruker nanoliter-volum av prøven er presentert. Metoden bruker en dispensering system med sub-nanoliter presisjon kontroll flytende opptak og EM rutenettet grunning, en plattform for å kontrollere rutenettet temperaturen dermed å finne relativ fuktighet over EM rutenettet, og en pick-og-stupe-mekanisme for eksempel vitrifikasjon. For cryo-EM, et EM rutenett er plassert på temperaturkontrollert scenen og prøven er aspirated inn en kapillær. Kapillær spissen er plassert i nærheten av rutenettet overflaten, rutenettet er lastet med prøven og overflødig er nytt aspirerede inn i microcapillary. Deretter er prøve filmen stabilisert og litt tynnet av kontrollert fordampning regulert av forskyvningen av plattform temperaturen i forhold til duggpunktet. På et gitt tidspunkt utløses pick-og-styrter mekanismen, raskt overføre primet EM rutenettet til flytende etan for eksempel vitrifikasjon. Eventuelt er prøve condition metoder tilgjengelig for å forberede nanoliter størrelse utvalg volumer for negative flekk (NS) EM.
Metodikkene sterkt redusere prøve og unngå tilnærminger skadelige proteiner, slik som filter papir blotting brukes i konvensjonelle metoder. Videre kan minuscule mengden prøve kreves romanen eksperimentelle strategier, for eksempel rask eksempel condition, sammen med encellede lysis for “visuelle Proteomikk” eller “lossless” totale eksempel forberedelse til kvantitativ analyse av komplekse eksempler.
Maskinvare og programvare for strukturell analyse av protein komplekser av overføring elektronmikroskop (TEM) har svært avanserte de siste årene. Forbedringene gjort banet vei til en “oppløsning revolution”1,2 og forandret strukturelle forskning. Revolusjonen startet med bruk av cryo-elektron mikroskopi (cryo-EM)3,4, tillater utarbeidelse av biologiske prøver under nær fysiologiske forhold mens redusere stråling følsomhet og hindre eksempel fordampning i høy vakuum overføring elektronmikroskop5. I de følgende årene økt inkrementell teknologiske fremskritt gradvis oppløsning oppnåelig. Blant disse nyvinningene ble programmet feltet-utslipp våpen6,7, og mer nylig forbedret data analysealgoritmer, for eksempel maksimal sannsynlighet metoder8,9. Direkte elektron detektor kameraer10,11,12,13, filmmodus imaging og tilhørende programvare utviklingen14,15, 16 , 17, gitt det endelige gjennombruddet kreves for å oppnå Atom løsning for biologiske prøver av én partikkel analyse (for en gjennomgang se Cheng, Grigorieff, et al. 18). betydningen av cryo-EM ble nylig anerkjent av tildelingen av Nobelprisen i kjemi tre av pionerene.
For å bilde et biologiske utvalg av TEM, måten du laste EM rutenettet med prøve (heretter referert til som “rutenett forberedelse”) må sikre at det resulterende eksempel laget (i) er tynne nok (< 100 nm) å unngå omfattende støy av uelastisk eller multiplisere spredt elektroner, (ii) tåler høy vakuum elektronmikroskop, og (iii) beskytter biomolecules mot stråling skader. To hovedmetoder brukes til å oppfylle disse godtgjørelser: Negative flekk(NS)19,20 prosedyrer (figur 1A) adsorberes prøven til en tynn karbon film, legge til biomolecules i amorfe heavy metal og deretter tillate at samlingen tørr luft. Dette er enkel og rask, og de lastet EM (heretter referert til som “eksempel rutenett”) er lett å lagre og kan oppbevares i lengre perioder (vanligvis år). I TEM, forberedelsene exhibit høy kontrast på grunn av NS og tåle høyere elektron doser enn cryo-preparater, men oppløsningen er begrenset til ca 20 Å. Cryo-EM prosedyrer (figur 1B) ansette holey karbon støtter. En tynn film av prøve løsningen er spredt over hullene og EM rutenettet er kastet inn i en cryogen, vanligvis flytende etan, raskt avkjøles den under-150 ° C. Resultatet er en amorf, vitrified, 50 til 100 nm-tykk film av løsningen i støtte hullene. Denne tynne, amorf filmen tåler høy vakuum i elektronmikroskop og i det ideelle tilfellet, bevarer biologiske strukturer i sin opprinnelige tilstand. Prosedyren kan biologiske prøver å avbildes i høy oppløsning. Imidlertid holdes prøve rutenettet ved temperaturer under-150 ° C hele tiden å unngå devitrification. Det kan avbildes bruker relativt høy elektron doser på grunn av lav temperatur, men kontrasten og signal-til-støy forholdet er likevel lav. Derfor snitt teknikker er ansatt for å øke kontrasten, og forutsatt at prøven er imaged fra forskjellige vinkler, en høy oppløsning tredimensjonalt (3D) kart kan bli rekonstruert. De mest brukte svært vellykket metode for 3D rekonstruksjon som nå er den eneste partikkel tilnærmingen. For en siste gjennomgang, kan du se Cheng al.18.
Negativ flekken TEM (NS-EM) er viktig for screening og kvalitetskontroll, når Høykontrast er nødvendig eller bare begrensede mengder utvalg er tilgjengelig (adsorpsjon til karbon filmen generelt konsentrerer utvalget). Enkelt partikkel cryo-EM er metoden gull-standard om høyoppløselige 3D rekonstruksjoner av protein er rettet for.
Figur 1: prinsipper av TEM rutenettet forberedelse og sammenligning mellom klassisk (panelet A, B) og en microfluidic tilnærming (panel C, D). A) klassisk NS-EM rutenettet forberedelse: om 3 µL av prøven er pipetted for hånd på en EM rutenett dekket med en kontinuerlig karbon film (senere referert til som en ‘NS-EM rutenett”) (i). Etter inkubasjon for ca 10 s, filter papir brukes å viske bort overflødig væske fra siden (ii), forlater den adsorbert biomolecules i en tynn vann film. Deretter protein er ruges i heavy metal salt løsning, f.eks, 2% uranyl acetate, for 20 s (iii), og igjen væske fjernes ved blotting fra siden ved hjelp av filter papir (iv). Til slutt, EM-rutenettet er igjen til tørk i luften. B) klassisk cryo-EM rutenettet forberedelse: om 3 µL av prøven er pipetted av en hånd på en holey karbon film. For å danne en tynn eksempel film, fjernes overflødig væske av papir-blotting ansikt på fra en eller begge sider (ii). Til slutt, rutenettet er raskt kastet inn flytende etan for vitrifikasjon (iii). C) NS-EM rutenettet forberedelse bruk cryoWriter: A 5 nL volum er pustende fra prøve lager ved hjelp av en microcapillary (i). For eksempel condition er microcapillary spissen nedsenket i condition løsningen, f.eks2% ammonium acetate. Ioner og små molekyler utveksles ved diffusjon (ii). Merk at dimensjonene for microcapillary sikre at hele prosessen er diffusjon drevet. Proteiner har mye lavere diffusjon konstanter enn salt ioner og er ikke betydelig mistet24. Endelig er prøven utlevert på rutenettet og lov til å tørke (iii). D) prinsipper cryo-EM rutenettet forberedelser med metoden cryoWriter-baserte: en EM rutenettet dekket med en holey karbon film er plassert på overflaten av en temperaturkontrollert plattform og holdt av pinsett. Temperaturen på plattformen styres på en forskjøvet fra duggpunkt temperaturen på rutenettet miljøet. Rutenettet flyttes i forhold til microcapillary som inneholder utvalget og microcapillary senkes før det er noen få mikrometer over rutenettet. Senere, er noen nanoliters av prøven utlevert fra den mens scenen flyttes i en spiral mønster; overskytende væske er nytt aspirerede (i). Etter EM rutenett grunning, trekkes microcapillary og rutenettet forblir på temperatur kontrollert plattform (heretter kalt duggpunkt (DP) scenen) for en kort tid til å tillate en kontrollert mengde å fordampe. For styrter frysing, er rutenettet raskt trukket fra scenen ved hjelp av pinsett (ii), vendes 90 ° i vertikal posisjon og stupte inn i et cryogen bad (iii) (senere referert til som “pick-og-styrter” mekanisme). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Dessverre rutenettet forberedelse metodene som brukes for NS og cryo-EM har ikke er vesentlig forbedret siden de ble oppfunnet. Gjeldende ulempene er høy eksempel forbruket (ca. 3 µL 1 mg/mL protein) og den store mengden (> 99%) i utvalg mistet (figur 1A, B). Videre klassisk måten du forberede rutenett cryo-EM er harde fremgangsmåte for proteiner: først det innebærer en omfattende ansikt på papir-blotting trinn (figur 1B, ii), og andre protein er eksponert for luft-vann-grensesnittet for en betydelig mengde tid21. Her en alternativ metode for prøven før condition, prøve rutenettet forberedelse og etterbehandling (rutenett tørking eller vitrifikasjon) for NS-EM (figur 1C) eller cryo-EM (figur 1D) er presentert. Huset bygget stilling, kalt “cryoWriter”, bruker miniatyriserte eksempel håndtering teknologi og microfluidic prinsipper å Sug opp tilstand og dispensere prøve, unngå papir blotting helt og gi alternative metoder for å tynne prøver for Cryo-EM. Det betydelig reduserer eksempel forbruk og bedre bruker-kontroll over eksempel forberedelse som helhet. Videre tillater den romanen eksperimentelle programmer. for eksempel utarbeidelsen av isolerte biologiske komponenter i enkeltceller i en metode kalt “enkelt celle visuelle Proteomikk”22,23,24,25.
‘CryoWriter’ instrumentet og protokollene som kreves for å forberede eksempelliste nett for NS – og cryo-EM fra nL størrelse totale eksempel volumer og helt unngå klassisk papir-blotting trinnet presenteres. Microfluidic prinsipper og et micromechanical kombineres i cryoWriter å gjøre dette mulig.
Vår erfaring viser at når miniatyriserte metodene i dette manuskriptet brukes parameteren plass til EM-rutenettet forberedelse er større enn klassisk metoder og strammere brukerstyrt. Viktigere, gjør den økte reproduserbarhet oppnådd det mulig å pre-skjermen med eksempel buffer system, supplert med en lett tilgjengelig test protein, til å bestemme de optimale parameterne før det aktuelle eksperimentet utføres. Dette holder forbruk av prøven av interesse til absolutte minimum anbefales. Avgjørende skritt for begge NS – og cryo-EM rutenettet forberedelse er: (i) grunning av pumpen; for sub-nanoliter volum dispensering, systemet væske (vann) skal degassed og bubble gratis. (ii) nøyaktig kontroll av glød utslipp eller plasma rengjøring trinn; overflaten kjennetegner EM rutenettet er avgjørende for reproduserbar resultater. (iii) eksempel condition; tiden som kreves for condition, f.eksmed NS, avhenger på bufferen type, saltinnhold og konsentrasjon (Figur 3), samt på munnstykket geometrien i microcapillary24. (iv) fordampning priser for NS-EM forberedelser for kvantitative EM; kaffe-ring effekten kan forby kvantitativ analyse NS-EM forberedelser, og må undertrykkes av langsom fordampning priser kontrollert av DP-scenen.
Ulike aspekter av presentert rutenettet forberedelse metoder kan kombineres fritt slik at utviklingen av allsidig protokoller for spesielle prøver. Typiske eksempler ville være fjerning av et stoff som hindrer høyoppløselig EM, f.eks, glyserol, et steg condition før rutenettet forberedelse til cryo-EM; innføring av megler molekyler, som ligander, ved condition før rutenettene er beredt, eller undersøkelse av enkelt celle lysate av NS – eller cryo-EM (figur 6).
Bruk av microfluidics og minimal eksempel beløp i metodene presentert fjerner fullstendig behovet for papir-blotting trinnene. Dette er en stor fordel, fordi papir blotting er en hard behandling for proteiner, potensielt forurensende prøven med uønskede ioner og iboende fører til massiv utvalg tap. På den annen side, unngås potensielt effekten av luft-vann-grensesnittet i tynne eksempel filmen dannet når cryo-EM prøver er forberedt på den klassiske måten ikke når cryoWriter brukes. Rutenett egnet for cryo-EM kan tilberedes med en mindre enn 0,2 s ventetiden mellom eksempelprogram og vitrifikasjon (data ikke vist). Men som proteiner reiser et par tiendedeler av en nanometer i noen nanosekunder med diffusjon, er det fortsatt nok tid for dem å kollidere med luft-vann-grensesnittet av en 100 nm tykk eksempel film flere ganger. Men hvor mye proteiner stikker i luft-vann-grensesnittet kan reduseres betydelig ved disse kort tid-huller og kan hindre protein rødsprit eller begrenset partikler retning. En annen lovende tilnærming som kan beskytte sensitive proteiner i luft-vann-grensesnittet er å dekke eksempel filmen med lav molekylvekt overflateaktive stoffer. Forbindelsene kan bli raskt introdusert av et condition skritt i cryoWriter før rutenettet forberedelse. Høy er overflate-til-volum microfluidic systemer en ytterligere begrensning av cryoWriter, som eksempel potensielt gå tapt ved uspesifikke adsorpsjon til microcapillary overflaten og forstyrre kvantitativ analyse av partikkel opptellingen. Problemet behandles på to måter: først prøven ikke reise lange avstander i microcapillary. Faktisk gjenstår nanoliter eksempel volumet på kapillære spissen hele behandlingen. Andre overflaten til volumkontrollen reduseres ytterligere ved å bruke microcapillaries med store indre diameter, f.eks, 180 µm. tredje, overflater av microcapillaries kan være enkelt passivated om nødvendig f.eksved å behandle dem med kommersielt tilgjengelig polylysine etanol glycols (PLL-PEG).
Høyoppløselig analyse av proteiner av én partikkel tilnærming brukes i EM krever bare 100 000 til noen millioner bilder av personlige protein partikler. Dette betyr at microfluidic teknikker kan gi nok protein komplekser for strukturelle etterforskningen. Miniatyriserte immuno-nedbør metode for rask isolering av protein komplekser (rundt 1 time) fra minimal celle beløp (ca. 40.000 celler) ble utviklet tidligere28. Denne metoden vil nå være direkte knyttet til miniatyriserte eksempel forberedelsen scene av cryoWriter. Det endelige målet er å utvikle en integrert microfluidic rørledning for ultra-rask protein isolasjon og cryo-EM rutenettet forberedelse som krever mindre enn to timer i alle. Videre, som demonstrert av figur 6minutt mengden og mengden materiale som er nødvendig for eksempel forberedelse og nesten lossless condition og rutenettet forberedelse prosedyre ved hjelp av cryoWriter, gjør det mulig å studere protein komplekser individuelle celler. Sammen legge miniatyriserte immuno-nedbør metoden og cryoWriter grunnlaget for en ny Proteomikk metode kalt “enkelt celle visuelle Proteomikk”, som vi nylig demonstrert for varme-shock eksperimenter24. Data analysealgoritmer rettet til analyse av “visuelle Proteomikk” bilder blir nå testet.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne gjerne takke verkstedet til Biozentrum av universitet Basel for deres støtte, S. A. Müller for viktige diskusjoner og nøye lese manuskriptet, A. Fecteau-og teknisk hjelp med EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann for membran protein test prøver (alle fra C-CINA, Biozentrum, Universitetet i Basel) og A. Engel, emeritus universitet Basel for hans inspirerende samtaler. Test prøver fotograferingen av P. Ringler, M.-A. Mahi, og T. Schwede (Biozentrum, Universitetet i Basel), P. Leiman (Laboratory av strukturell biologi og biofysikk, EPFL) og R. Diaz-Avalos (New York strukturell biologi Center, USA). Prosjektet ble støttet av sveitsiske nanovitenskap Institute (SNI, prosjektet P1401, ARGOVIA prosjektet MiPIS) og sveitsiske National Science Foundation (SNF, prosjektet 200021_162521).
Liquid handling | |||
Microcapillary tip | New Objective | FS360-100-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 100 µm ID , pk. 20 |
FS360-150-30-N-20 | SilicaTips 30 µm tip ID, 150 µm ID , pk. 20 | ||
Conductive sleeve | New Objective | CONGAS-1 | Conductive Elastomer for HV contact, 12" long |
Fused silica tubing | BGB-Analytik | TSP-150375 | TSP Standard FS Tubing, 150 µm ID, 363 µm OD, 5 meter |
PressFit Connector | BGB-Analytik | 2525LD | Deact. PressFit Connector 0.25 to 0.25 mm ID, pk. 25 |
Syringe 10 µl | BGB-Analytik | HA-80001 | Hamilton 1701 LT – Luer Tip (needle not included) |
Syringe pump controller | Cetoni | A3921000093 | neMESYS controller |
Syringe pump dosing unit | Cetoni | A3921000095 | neMESYS dosing unit |
Temperature control | |||
Dew point sensor | Meltec | UFT75-AT | Humidity/Temperature sensor, dew point calculation, USB and embedded DLL |
Temperature sensor | Sensorshop24.ch | LS7-PT1000-1.0-3L | Surface mountable temperature sensor Pt1000 |
Peltier controller | Cooltronic | TC2812 | PID temperature controller for activation of Peltier driven systems with constant voltage output |
Peltier element | Distrelec.ch | PE-127-14-15-S | 40×40 mm |
Water-cooling block | – | – | Water cooling block for 40×40 mm peltier element, copper base |
Water pump | Digitec.ch | 294877 | XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Black V4 |
Water heat exchanger block | – | – | Water heat exchanger block with 2 fans to cool down circulating water |
Small water coolers | PCHC.ch | 223050 | Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs |
Small peltier elements | Distrelec.ch | PE-031-10-15-S | Laird 15×15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 °C, 2 pcs |
Mechanics | |||
Linear stage z-axis | Dyneos AG | M-404.2PD | High-load precision translational stage, 50 mm travel range, DC motor |
Stage controller | Dyneos AG | C-863 | Mercury Servo Controller |
Microscope xy-axis stage | Prior Scientific | H117EIL5 | Motorized stage for Zeiss Axiovert 200 inverted microscope |
Small permanent magnets | Supermagnete | S-05-08-N | Rod magnet Ø 5 mm, height 8.47 mm, neodymium, N45, nickel-plated, pk. 10 |
Small electromagnet | Schramme | EG1025A02/110 | Electromagnet 24V 220 N 150 N 2,5 W |
Controller electromagnet | Conrad.ch | MST-1630.001 7 | Electromagnet control PCB board |
Solenoid hub | Distrelec.ch | HD8286-R-F-24V100% | Kuhnke Solenid Hub 30 mm 16 N 2 N 16 W |
Mini tweezers | Electron Microscopy Sciences | 0302-M5S-PS | Dumont Type 5 mini, super thin tips |
Various optomechanical parts | Thorlabs | – | – |
Various mechanical parts | Workshop Biozentrum, University Basel | – | Custom designed adapter plates, holders, etc. see attached CAD files |
Optics | |||
Laser diode | Thorlabs | CPS780S | 780 nm laser diode module 2.5 mW |
Photo detector | Thorlabs | PDA100A-EC | Si Switchable Gain Detector, 320-1100 nm, 2.4 MHz BW, 100 mm2 |
EM grids | |||
DURASIN FILM TEM | emsdiasum.com | DTF-03523 | 30 nm DuraSiN™ silicon nitride membranes for TEM, pack of 5 |
Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3 | Quantifoil Micro Tools GmbH | ||
Buffers / Neg. stain | |||
PBS | Sigma | D8537 SIGMA | Dulbecco’s Phosphate Buffered Saline |
NanoVan 2% | nanoprobes.com | Negative stain vanadium based | |
NanoW 2% | nanoprobes.com | Negative stain tungsten based | |
Software | |||
openBEB | The openBEB 2 framework is avaible upon request, version 3 will be downloadable | ||
CryoWriter control software (openBEB plugin) | Avaible upon request, extra fees for 3rd party driver software might apply. |