CRISPR-medieret tab af funktion analyse i cerebellare granula celler ved hjælp af In Utero elektroporation-baseret overførsel af gener
Summary
Konventionelle tab af funktion undersøgelser af gener ved hjælp af knockout dyr har ofte været dyrt og tidskrævende. Elektroporation-baseret CRISPR-medieret somatiske mutagenese er et kraftfuldt værktøj til at forstå genet fungerer in vivo. Her rapporterer vi en metode til at analysere knockout fænotyper i prolifererende celler af lillehjernen.
Abstract
Hjernen misdannelser er ofte forårsaget af genetiske mutationer. Decifrere mutationer i patient-afledte væv har identificeret potentielle årsagsfaktorer af sygdomme. For at validere bidrag af en dysfunktion af de muterede gener til udvikling af sygdom, er generation af dyremodeller transporterer mutationerne en indlysende fremgangsmåde. Mens kønscelleoverførsel genetisk manipuleret musemodeller (GEMMs) er populære biologiske værktøjer og udstille reproducerbare resultater, det er begrænset af tid og omkostninger. I mellemtiden, ikke-genom GEMMs ofte aktiverer udforske genfunktion i en mere realistisk måde. Siden nogle hjerne sygdomme (fx, hjernetumorer) synes at være resultatet af somatiske men ikke kønscelleoverførsel mutationer, ikke-kønscelleoverførsel kimære musemodeller, hvor normale og unormale celler sameksistere, kunne være nyttigt for sygdom-relevant analyse. I denne undersøgelse rapport vi en metode til induktion af CRISPR-medieret somatiske mutationer i lillehjernen. Specifikt, vi udnyttede betinget knock-i mus, hvor Cas9 og normal god landbrugspraksis er kronisk aktiveres af CAG (CMV forstærker/kylling ß-actin) promotor efter Cre-medieret rekombination af genomet. Den selvstændige designet enkelt-guide RNA’er (sgRNAs) og Cre recombinase sekvens, både kodet i et enkelt plasmid konstruktion, blev leveret til cerebellare stilk/stamceller på en embryonale stadie benytter i utero elektroporation. Derfor var transfekteret celler og deres datter celler mærket med grøn fluorescerende proteiner (NGL), således at lette yderligere fænotypiske analyser. Derfor, denne metode ikke kun viser elektroporation-baserede gen levering i cerebellare Embryoceller men også foreslå en roman kvantitative tilgang for at vurdere CRISPR-medieret tab af funktion fænotyper.
Introduction
Hjernesygdomme er en af de mest forfærdelige dødelige sygdomme. De skyldes ofte genetiske mutationer og efterfølgende dysregulering. For at forstå molekylære mekanismer af hjernesygdomme, har nogensinde langvarige bestræbelser på at dechifrere genomer af menneskelige patienter opdaget en række potentielle sygdomsfremkaldende gener. Hidtil, har været udnyttet kønscelleoverførsel genetisk manipuleret dyremodeller for in vivo gevinst-af-funktion (GOF) og tab af funktion (LOF) analyser af sådanne kandidat gener. På grund af den fremskyndede udviklingen af funktionelle valideringsundersøgelser, en mere realistisk og fleksibel i vivo gen assay system for at studere genfunktion er ønskeligt.
Anvendelse af en in vivo elektroporation-baserede gen overførsel systemet at udvikle mus hjernen er velegnet til dette formål. Faktisk har flere undersøgelser, i utero elektroporation vist deres potentiale til at gennemføre funktionelle analyser i udviklingslandene hjernen1,2,3. Faktisk, flere regioner i mus hjernen, såsom cerebral cortex4, nethinden5, diencephalon6, baghjernen7, lillehjernen8og rygmarven9 er blevet angrebet af somatiske gen levering tilgange, så langt.
Faktisk, forbigående genekspression af i vivo elektroporation på embryonale mus hjerner har længe været anvendt til GOF analyse. Seneste transposon-baserede genomisk integration teknologier yderligere aktiveret langsigtet og/eller betingede udtryk af gener af interesse10,11, hvilket er en fordel at dissekere genfunktion i en rumlig og tidsmæssig måde under udvikling. I modsætning til GOF analyse, har LOF analyse været mere udfordrende. Mens forbigående Transfektion af siRNAs og shRNA-regnskabsmæssige plasmider blev udført, er langsigtede virkninger af LOF af gener ikke garanteret på grund af eventuel forringelse af eksogent indførte nukleinsyrer, såsom plasmider og dsRNAs. CRISPR/Cas-teknologien giver imidlertid et gennembrud i LOF analyser. Gener kodning fluorescerende proteiner (f.eks.normal god landbrugspraksis) eller en bioluminescerende proteiner (fxfirefly luciferase) har været co transfekteret med CRISPR-Cas9 og sgRNAs til at mærke de celler udsat for CRISPR-Cas9-medieret somatiske mutationer. Ikke desto mindre, denne tilgang kan have begrænsninger i funktionelle studier om prolifererende celler, da eksogene markørgener er udvandet og forringet efter langsigtede spredning. Mens de transfected celler og deres datter celler gennemgå CRISPR-induceret mutationer i deres genomer, kan deres fodspor få tabt over tid. Genetiske mærkning tilgange vil således egnet til at overvinde dette problem.
Vi har for nylig udviklet en CRISPR-baseret LOF metode i cerebellare granula celler, der undergår langsigtede spredning under deres differentiering12. At genetisk mærke de transfected celler, vi bygget et plasmid, bærer en sgRNA sammen med Cre og indført plasmidet i cerebella af Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus13 bruger i utero elektroporation. I modsætning til regelmæssig plasmid vektorer kodning EGFP, denne fremgangsmåde med succes mærket transfekteret granula neuron prækursorer (BNI) og deres datter celler. Denne metode giver stor støtte i forståelse in vivo funktion af gener af interesse i prolifererende celler i normal hjernens udvikling og en tumor-tilbøjelige baggrund.
Protocol
Representative Results
Discussion
Brug exo utero elektroporation, har vi tidligere rapporteret, siRNA-baseret i vivo funktionelle analyser af Atoh1 på et tidligt stadium af cerebellare granula celle differentiering8. SiRNA fortynding/nedbrydning og eksponering af embryoner uden for livmodervæggen var fænotypiske analyser af electroporated granula celler begrænset til vorden. Men den nuværende metode aktiveret analyse af Fænotypen af postnatal dyr.
Vores tidligere undersøgelse vi…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi sætter pris på Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim og Petra Schroeter for teknisk bistand. Vi takker også Drs. K. Reifenberg, K. Dell og P. Prückl for nyttige støtte til dyreforsøg på DKFZ; den Imaging Core faciliteter af DKFZ og Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ for konfokalmikroskopi billeddannelse. Dette arbejde blev støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (til D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
Referências
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
