पारंपरिक नुकसान-की-समारोह जीन नॉकआउट जानवरों का उपयोग कर के अध्ययन अक्सर महंगा हो गया है और समय लेने वाली । Electroporation आधारित CRISPR-मध्यस्थता दैहिक mutagenesis vivo मेंजीन कार्यों को समझने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है । यहां, हम सेरिबैलम के proliferating कोशिकाओं में नॉकआउट phenotypes का विश्लेषण करने के लिए एक विधि की रिपोर्ट ।
मस्तिष्क कुरूपता अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों के कारण होता है । रोगी-व्युत्पन्न ऊतकों में उत्परिवर्तनों का गूढ़ रूप से रोगों के संभावित करणीय कारकों की पहचान की है । रोग के विकास के लिए रूपांतरित जीन की एक शिथिलता के योगदान को मांय करने के लिए, पशु उत्परिवर्तनों ले मॉडल की पीढ़ी के एक स्पष्ट दृष्टिकोण है । जबकि germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर माउस मॉडल (GEMMs) लोकप्रिय जैविक उपकरण और प्रदर्शन reproducible परिणाम हैं, यह समय और लागत से प्रतिबंधित है । इस बीच, गैर germline GEMMs अक्सर एक अधिक व्यावहारिक तरीके से जीन समारोह की खोज सक्षम करें । के बाद से कुछ मस्तिष्क रोगों (जैसे, ब्रेन ट्यूमर) दैहिक लेकिन नहीं germline उत्परिवर्तनों से परिणाम दिखाई देते हैं, गैर germline chimeric माउस मॉडल, जिसमें सामांय और असामांय कोशिकाओं के एक साथ रहना, रोग प्रासंगिक विश्लेषण के लिए उपयोगी हो सकता है । इस अध्ययन में, हम सेरिबैलम में CRISPR की मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों की प्रेरण के लिए एक विधि की रिपोर्ट । विशेष रूप से, हमने सशर्त दस्तक-चूहों का उपयोग किया, जिसमें Cas9 और GFP के जीनोम के Cre-मध्यस्थ पुनर्संयोजन के बाद सीएजी (सीएमवी बढ़ाने वाले/चिकन अ ß य-actin) प्रवर्तक द्वारा जीर्ण रूप से सक्रिय किए जाते हैं । स्व-डिजाइन एकल गाइड RNAs (sgRNAs) और Cre recombinase अनुक्रम, दोनों एक एकल प्लाज्मिड निर्माण में इनकोडिंग, अनुमस्तिष्क स्टेम में एक भ्रूण जनक utero में उपयोग कर चरण/electroporation कोशिकाओं में वितरित किया गया । नतीजतन, transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी कोशिकाओं को हरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन (GFP), इस प्रकार आगे phenotypic विश्लेषण की सुविधा के साथ लेबल थे । इसलिए, इस विधि electroporation नहीं दिखा रहा है केवल भ्रूण अनुमस्तिष्क कोशिकाओं में जीन वितरण आधारित है, लेकिन यह भी एक उपंयास मात्रात्मक दृष्टिकोण के लिए CRISPR-मध्यस्थता हानि-समारोह phenotypes का आकलन का प्रस्ताव ।
मस्तिष्क रोगों सबसे भयानक नश्वर रोगों में से एक हैं । वे अक्सर आनुवंशिक उत्परिवर्तनों और बाद में dysregulation से परिणाम । मस्तिष्क रोगों के आणविक तंत्र को समझने के लिए, कभी मानव रोगियों के जीनोम को समझने के लिए स्थाई प्रयासों संभावित करणीय जीन की एक संख्या की खोज की है । अब तक, germline आनुवंशिक रूप से इंजीनियर पशु मॉडल vivo लाभ में समारोह के लिए उपयोग किया गया है (गोफ) और नुकसान की-समारोह (LOF) ऐसे उंमीदवार जीन का विश्लेषण । कार्यात्मक सत्यापन अध्ययन के त्वरित विकास के कारण, एक और अधिक व्यवहार्य और व्यावहारिक जीन समारोह का अध्ययन करने के लिए vivo जीन परख प्रणाली में लचीला वांछनीय है ।
vivo electroporation-आधारित जीन अंतरण प्रणाली में विकासशील माउस मस्तिष्क के लिए एक के आवेदन इस प्रयोजन के लिए उपयुक्त है । वास्तव में, कई अध्ययनों utero electroporation में उपयोग कर अपनी क्षमता के लिए विकासशील मस्तिष्क1,2,3में कार्यात्मक विश्लेषण आचरण दिखाया है । दरअसल, इस तरह के सेरेब्रल प्रांतस्था4के रूप में माउस मस्तिष्क, के कई क्षेत्रों, रेटिना5, diencephalon6, hindbrain7, सेरिबैलम8, और रीढ़ की हड्डी9 दैहिक जीन डिलिवरी द्वारा लक्षित किया गया है दृष्टिकोण, अब तक ।
दरअसल, भ्रूण माउस दिमाग पर vivo electroporation में क्षणिक जीन अभिव्यक्ति लंबे समय गोफ विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया है । हाल ही में transposon आधारित जीनोमिक एकीकरण प्रौद्योगिकियों के आगे सक्षम दीर्घकालिक और/या ब्याज की जीन की सशर्त अभिव्यक्ति10,11, जो के दौरान एक स्थानिक और लौकिक तरीके से काटना जीन समारोह के लिए लाभप्रद है विकास. गोफ विश्लेषण के विपरीत LOF विश्लेषण अधिक चुनौतीपूर्ण रहा है । जबकि siRNAs और shRNA के क्षणिक अभिकर्मक-ले plasmids प्रदर्शन किया गया था, जीन की LOF के दीर्घकालिक प्रभाव exogenously और न्यूक्लिक जैसे plasmids एसिड, शुरू की अंतिम गिरावट के कारण की गारंटी नहीं कर रहे हैं । हालांकि, CRISPR/Cas प्रौद्योगिकी LOF विश्लेषण में एक ब्रेक के माध्यम से प्रदान करता है । फ्लोरोसेंट प्रोटीन एंकोडिंग जीन (जैसे, GFP) या bioluminescent प्रोटीन (जैसे, जुगनू luciferase) गया है सह CRISPR के साथ transfected-Cas9 और sgRNAs-CRISPR-मध्यस्थता दैहिक उत्परिवर्तनों से अवगत कराया कोशिकाओं लेबल के लिए । फिर भी, इस दृष्टिकोण proliferating कोशिकाओं पर कार्यात्मक अध्ययन में सीमाएं हो सकती है, के बाद से exogenous मार्कर जीन पतला और लंबी अवधि के प्रसार के बाद नीचा दिखा रहे हैं । जबकि transfected कोशिकाओं और उनकी बेटी की कोशिकाओं को अपने जीनोम में CRISPR-प्रेरित उत्परिवर्तनों से गुजरना, उनके पैरों के निशान समय पर खो सकता है । इस प्रकार, आनुवंशिक लेबलिंग दृष्टिकोण इस मुद्दे पर काबू पाने के लिए उपयुक्त होगा ।
हम हाल ही में अनुमस्तिष्क granules कोशिकाओं है कि उनके भेदभाव12के दौरान लंबी अवधि के प्रसार से गुजरना में एक CRISPR आधारित LOF विधि विकसित की है । transfected कोशिकाओं को आनुवंशिक रूप से लेबल करने के लिए, हमने Cre के साथ एक sgRNA ले जा रहे प्लाज्मिड का निर्माण किया और प्लाज्मिड cerebella-सीएजी-Rosa26-LSL-Cas9-P2A चूहों13 EGFP के utero में शुरू कर दिया । नियमित प्लाज्मिड वैक्टर EGFP एंकोडिंग के विपरीत, इस दृष्टिकोण सफलतापूर्वक transfected granules ंयूरॉन पुरोगामी (GNPs) और उनकी बेटी कोशिकाओं लेबल । इस विधि सामांय मस्तिष्क विकास और एक ट्यूमर की संभावना पृष्ठभूमि में proliferating कोशिकाओं में रुचि के जीन के समारोह vivo में समझ में महान समर्थन प्रदान करता है ।
exo utero electroporation का प्रयोग, हम पहले सिरना की सूचना दी है-Atoh1 के एक प्रारंभिक चरण में vivo कार्यात्मक विश्लेषण में अनुमस्तिष्क granules सेल भेदभाव8के आधार पर । गर्भाशय की दीवार के बाहर भ्रूण के सिरना कमजो…
The authors have nothing to disclose.
हम तकनीकी सहायता के लिए लौरा Sieber, अंना Neuerburg, Yassin हरिँ, और पेट्रा Schroeter की सराहना करते हैं । हम डीआरएस को भी धन्यवाद देते हैं । DKFZ में पशु प्रयोगों के लिए सहायक सहायता के लिए Reifenberg, के. डेल और पी Prückl; इमेजिंग कोर की सुविधाएं DKFZ और कार्ल जीस इमेजिंग केंद्र के DKFZ में फोकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के लिए । यह काम ड्यूश Forschungsgemeinschaft द्वारा समर्थित किया गया था, 4472/1-1 KA (to डी.) ।
Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
Cloth | Tork | 530378 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Ethanol | Merck | 107017 | |
Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
Fast Green | Merck | 104022 | |
FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
Metamizol | WDT | – | |
Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
Microinjector | Narishige | IM300 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |