CRISPR-mediert tap av funksjon analyse i lillehjernen Granule celler ved hjelp av In Utero Electroporation-baserte genoverføring
Summary
Konvensjonelle tap-av-funksjon studier av gener bruke knockout dyr er ofte kostbare og tidkrevende. Electroporation-baserte CRISPR-mediert somatisk mutagenese er et kraftig verktøy for å forstå gen fungerer i vivo. Her rapporterer vi en metode for å analysere knockout fenotyper i voksende celler av lillehjernen.
Abstract
Misdannelse hjernen er ofte forårsaket av genetiske mutasjoner. Tyde mutasjoner i pasient-avledede vev har identifisert potensielle årsaksfaktorer av sykdommer. For å validere bidrag av en dysfunksjon av muterte genene sykdom utvikling, er generering av dyremodeller bærer mutasjoner en tydelig måte. Mens germline genmodifiserte musen modeller (GEMMs) er populære biologiske verktøy og utstillingen reproduserbar resultater, det er begrenset av tid og kostnader. I mellomtiden aktivere ikke-germline GEMMs ofte utforske gen funksjon på en mer mulig måte. Siden noen brain sykdommer (f.eks, hjernesvulster) synes å skyldes somatiske men ikke germline mutasjoner, ikke-germline chimeric musen modeller, som normale og unormale celler eksistere, kan være nyttig for sykdom-relevant analyse. I denne studien rapporterer vi en metode for induksjon av CRISPR-mediert somatiske mutasjoner i lillehjernen. Spesielt vi utnyttet betinget banke i mus, som Cas9 og GFP kronisk aktiveres av CAG (CMV enhancer/kylling ß-utgangen) selskapet etter grobunn-mediert rekombinasjon i genomet. Egenutviklede single-guiden RNAs (sgRNAs) og grobunn recombinase rekkefølgen, både kodet i et enkelt plasmider konstruksjonen ble levert i lillehjernen stammen/stamfar celler på en gryende scenen med electroporation i utero . Følgelig ble transfekterte cellene og deres datter merket med grønne fluorescerende protein (GFP), dermed tilrettelegge ytterligere fenotypiske analyser. Derfor, denne metoden er ikke bare viser electroporation-baserte gen levering i embryonale lillehjernen celler, men foreslår en ny kvantitativ tilnærming for å vurdere CRISPR-mediert tap-av-funksjon fenotyper.
Introduction
Brain sykdommer er en av de mest forferdelige dødelige sykdommene. De skyldes ofte genetiske mutasjoner og påfølgende feilregulering. For å forstå molekylære mekanismer av brain sykdommer, har evigvarende innsats å dechiffrere genomer av menneskelige pasienter oppdaget en rekke potensielle forårsaker gener. Så langt har germline genmodifiserte dyr modeller vært benyttet i vivo gevinst-av-funksjon (GOF) og tap-av-funksjon (LOF) analyser av slike kandidat gener. Akselerert utbygging av funksjonelle validering studier er et mer gjennomførbart og fleksibel i vivo genet analysen system for å studere gen funksjon ønskelig.
Bruk av en i vivo electroporation-baserte genet overføring-system for å utvikle musen hjernen er egnet for dette formålet. Faktisk, har flere studier bruker i utero electroporation vist sitt potensial til å utføre funksjonelle analyser i utvikle hjernen1,2,3. Faktisk, flere områder av musen hjernen, som hjernebarken4, netthinnen5, diencephalon6, hindbrain7, lillehjernen8og ryggmargen9 har vært målrettet av somatiske gen levering tilnærminger, så langt.
Faktisk har forbigående genuttrykk av i vivo electroporation på embryonale musen hjerner lenge vært brukt for GOF analyse. Siste transposon-baserte genomisk integrasjon teknologi ytterligere aktivert langsiktig og/eller betingede uttrykket av gener av rundt10,11, som er en fordel å dissekere gen funksjon på en romlig og tidsmessige måte under utvikling. I motsetning til GOF analyse er LOF analyse mer utfordrende. Mens forbigående hva siRNAs og shRNA-bærer plasmider ble utført, garanteres ikke langtidseffekter av LOF av gener på grunn av eventuell nedbrytning av exogenously introdusert nucleic syrer, for eksempel plasmider og dsRNAs. CRISPR/Cas teknologien gir imidlertid et gjennombrudd i LOF analyser. Gener som koder fluorescerende proteiner (f.eksGFP) eller bioluminescent proteiner (f.eksfirefly luciferase) har vært co transfekterte med CRISPR-Cas9 og sgRNAs for å merke cellene utsatt for CRISPR-Cas9-mediert somatiske mutasjoner. Likevel kan denne tilnærmingen ha begrensninger i funksjonelle studier på voksende celler, siden eksogene markør gener er utvannet og degradert etter langsiktige spredning. Mens de transfekterte cellene og deres datter gjennomgår CRISPR-indusert mutasjoner i deres genomer, kan sine fotavtrykk få tapt over tid. Dermed ville genetisk merking tilnærminger være egnet til å overvinne problemet.
Vi har nylig utviklet en CRISPR-baserte LOF metode i lillehjernen granule celler som gjennomgår langsiktige spredning under deres differensiering12. Hvis genetisk etiketten transfekterte cellene, vi bygget en plasmider bærer en sgRNA sammen med grobunn og introdusert av plasmider i cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP mus13 bruker i utero electroporation. I motsetning til vanlige plasmider vektorer koding EGFP, dette merket ble transfekterte-granulen Nevron prekursorer (GNPs) og deres datter celler. Denne metoden gir god støtte forstå i vivo funksjon av gener av interesse i voksende celler i normal hjernens utvikling og svulst utsatt bakgrunn.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruker exo utero electroporation, har vi tidligere rapportert siRNA-basert i vivo funksjonelle analyser av Atoh1 på et tidlig stadium av lillehjernen granule celle differensiering8. SiRNA fortynning/fornedrelse og eksponering av embryo utenfor livmor veggen var fenotypiske analyse av electroporated-granulen cellene begrenset til embryonale stadier. Imidlertid aktivert det aktuelle metoden analyse av fenotypen av postnatal dyr.
Vår forrige studie vist…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim og Petra Schroeter for teknisk assistanse. Vi takker også Dr. K. Reifenberg og K. Dell P. Prückl nyttig hjelp for dyreforsøk på DKFZ; Imaging Core fasilitetene på DKFZ og Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ for AC confocal mikroskopi bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet av Deutsche Forschungsgemeinschaft, KA 4472/1-1 (til dk).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
Referências
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
