Обычные потери функции исследования генов с помощью маскирования животных часто были дорогостоящим и трудоемким. Электропорация основанный ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутагенеза является мощным инструментом, чтобы понять, что ген функционирует в естественных условиях. Здесь мы приводим метод для анализа нокаут Фенотипы пролиферирующих клеток мозжечка.
Пороки развития головного мозга часто является причиной генетических мутаций. Расшифровка мутации в тканях пациента производный выявила потенциальные причинных факторов заболеваний. Чтобы проверить вклад дисфункции мутировавших генов для развития болезни, поколения животных моделей, перевозящих мутации — один очевидный подход. Хотя микрофлорой генетически модифицированные мыши модели (GEMMs) являются популярных биологических средств и воспроизводимые результаты, он ограничен по времени и расходов. Между тем не микрофлорой GEMMs часто позволяют изучить функции гена более осуществимым образом. Поскольку некоторые мозга заболевания (например, опухоли головного мозга), как представляется, в результате соматических но не герминальных мутаций, не микрофлорой химерных мыши модели, в которой сосуществуют нормальных и ненормальных клеток, может быть полезным для болезни значимого анализа. В этом исследовании мы приводим метод для индукции ТРИФОСФАТЫ опосредованной соматических мутаций в мозжечке. В частности, мы использовали условное стук в мышей, в которых Cas9 GFP хронически активизируются и промоутер CAG (ЦМВ усилитель/курица ß миозина) после Cre-опосредованной рекомбинации генома. Самостоятельно разработанные сингл руководство РНК (sgRNAs) и Cre рекомбиназа последовательности, оба закодированы в одной плазмидные конструкции, были доставлены в мозжечковой стволовых/прогениторных клеток на эмбриональном этапе с помощью электропорации в утробе матери . Следовательно Зеленый флуоресцентный белок (КГВ), способствуя тем самым далее фенотипические анализы были помечены transfected клеток и их дочь клетки. Следовательно этот метод не только показаны доставки на основе электропорации гена в эмбриональных клеток мозжечка, но предлагает также Роман количественный подход к оценке ТРИФОСФАТЫ опосредованной фенотипов потери функции.
Заболевания головного мозга являются одним из самых страшных смертельной болезни. Они часто являются результатом генетических мутаций и последующей регуляции. Чтобы понять молекулярные механизмы заболеваний головного мозга, когда-либо прочного усилия расшифровать геном человека пациентов обнаружили ряд возможных причинных генов. До настоящего времени микрофлорой генетически модифицированные Животные модели были использованы в естественных условиях получить из функции (Гоф) и потери функции (LOF) анализ генов такого кандидата. Из-за ускоренного развития функциональной проверки исследований желательно более осуществимым и гибкие в vivo гена пробирного систему для изучения функции гена.
Применение системы передачи на основе электропорации гена в естественных условиях на развивающийся мозг мыши подходит для этой цели. В самом деле несколько исследований, с использованием в утробе матери электропорации показали свой потенциал для проведения функционального анализа в развивающегося мозга1,2,3. На самом деле несколько регионов мозга мыши, например коре4, сетчатки5, таламус6, задний мозг7, мозжечок8и спинного9 были мишенью соматическая генная доставки подходы, пока.
Действительно выражение переходных гена путем электропорации в естественных условиях на мозги эмбриона мыши уже давно используется для GOF анализа. Последние технологии на основе transposon геномной интеграции далее включены долгосрочные и/или условное выражение генов интерес10,11, который выгодно чтобы вскрыть функции гена на основе пространственных и временных во время развития. В отличие от GOF анализ анализ LOF была более сложной. Хотя была выполнена переходных трансфекции малые интерферирующие РНК и перевозящих индуцируемый плазмид, долгосрочные последствия LOF генов не гарантируется из-за возможной деградации экзогенно введено нуклеиновых кислот, таких как плазмидов и двуцепочечных РНК. Однако ТРИФОСФАТЫ/Cas технология обеспечивает прорыв в LOF анализы. Гены, кодирующие флуоресцентных белков (например, GFP) или биолюминесцентных белков (например, Светлячок Люцифераза) были совместно transfected ТРИФОСФАТЫ-Cas9 и sgRNAs для обозначения клетки подвергаются ТРИФОСФАТЫ-Cas9-опосредованной соматических мутаций. Тем не менее этот подход может иметь ограничения в функциональных исследований пролиферирующих клеток, так как разбавленный и деградированных после долгосрочного распространения экзогенных маркерных генов. В то время как transfected клеток и их дочь клетки претерпевают ТРИФОСФАТЫ индуцированной мутации в их геном, их следы могут заблудиться со временем. Таким образом генетических меток подходов будет подходящим для преодоления этой проблемы.
Мы недавно разработали метод основанный ТРИФОСФАТЫ LOF в клетках мозжечковой гранул, которые проходят долгосрочного распространения во время их дифференциации12. Генетически маркировать transfected клеток, мы построен плазмида, перевозящих sgRNA вместе с КРР и введены плазмида cerebella Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP мышей13 с помощью электропорации в утробе матери . В отличие от обычных плазмида векторов кодирования EGFP, этот подход успешно помечены грануле transfected нейрон прекурсоров (ВНП) и их дочь клетки. Этот метод обеспечивает большую поддержку в понимании в естественных условиях функции генов интерес в пролиферирующих клеток в развитие нормального мозга и опухоли подверженных фон.
С помощью электропорации exo внутриутробно , мы уже ранее сообщали, что на основе малых интерферирующих РНК в vivo функциональный анализ Atoh1 на ранней стадии мозжечковой гранулы ячейки дифференцировки8. Из-за малых интерферирующих РНК разрежения/деградации и воздейс…
The authors have nothing to disclose.
Мы ценим Лаура Sieber, Анна Нойербург, Ясин Harim и Петра Шретер для оказания технической помощи. Мы также благодарим Drs. K. Райфенберг, K. Dell и P. Prückl за полезную помощь для экспериментов на животных в DKFZ; Imaging основной зал DKFZ и Carl Zeiss изображений центра в DKFZ для воображения confocal микроскопии. Эта работа была поддержана Deutsche Forschungsgemeinschaft, ка 4472/1-1 (д.к.).
Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
Cloth | Tork | 530378 | |
Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
Ethanol | Merck | 107017 | |
Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
Fast Green | Merck | 104022 | |
FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
Metamizol | WDT | – | |
Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
Microinjector | Narishige | IM300 | |
Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
T4 PNK | NEB | M0201S | |
Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |