CRISPR-medierad förlust av funktion analys i lillhjärnan Granule celler med hjälp av In Utero elektroporation-baserade genöverföring
Summary
Konventionella förlust-av-funktion studier av gener med knockout djur har ofta kostsamma och tidskrävande. Elektroporation-baserade CRISPR-medierad somatiska mutagenes är ett kraftfullt verktyg att förstå genen fungerar i vivo. Vi rapporterar här, en metod att analysera knockout fenotyper i prolifererande celler av lillhjärnan.
Abstract
Hjärna missbildning är ofta orsakas av genetiska mutationer. Dechiffrera mutationerna i patientderiverade vävnader har identifierat potentiella orsakande faktorer av sjukdomar. För att validera en dysfunktion av muterade generna att sjukdomsutvecklingen bidrag, är generationen av djurmodeller som transporterar mutationerna en självklar strategi. Medan könsceller genetiskt modifierade musmodeller (GEMMs) är populära biologiska verktyg och uppvisar reproducerbara resultat, den är begränsad av tid och kostnader. Under tiden aktivera icke-könsceller GEMMs ofta utforska geners funktion i ett mer genomförbart sätt. Sedan några hjärnans sjukdomar (t.ex., hjärntumörer) tycks resultera från somatiska men inte könsceller mutationer, icke-könsceller chimär musmodeller, där normala och onormala celler samexistera, kunde vara till hjälp för sjukdom-relevanta analyser. I denna studie redovisar vi en metod för induktion av CRISPR-medierad somatiska mutationer i lillhjärnan. Specifikt, utnyttjade vi villkorlig inpressning möss, där Cas9 och god Jordbrukarsed kroniskt aktiveras av CAG (CMV förstärkare/kyckling ß-aktin) Arrangören efter Cre-medierad rekombination av genomet. Egendesignade singel-guiden RNAs (sgRNAs) och Cre recombinase sekvensen, båda kodade i en enda plasmid konstruktion, levererades till lillhjärnan stjälk/stamceller på ett embryonala Stadium använder Utero elektroporation. Följaktligen, transfekterade celler och deras dotter celler var märkt med grönt fluorescerande protein (GFP), vilket underlättar ytterligare fenotypiska analyser. Därför, denna metod är inte bara visar elektroporation-baserade gen leverans till embryonala cerebellär celler men föreslår också en ny kvantitativ metod för att bedöma CRISPR-medierad förlust-av-funktion fenotyper.
Introduction
Sjukdomar i hjärnan är en av de mest fruktansvärda dödliga sjukdomarna. De resulterar ofta från genetiska mutationer och efterföljande dysreglering. För att förstå molekylära mekanismer för sjukdomar i hjärnan, har evig ansträngningar att dechiffrera genomen hos mänskliga patienter upptäckt ett antal potentiella orsakande gener. Könsceller genetiskt manipulerade djurmodeller har hittills utnyttjats för i vivo gain-of-function (GOF) och förlust-av-funktion (LOF) analyser av sådana kandidatgener. På grund av påskyndade utvecklingen av funktionella valideringsstudier är en mer genomförbar och flexibla i vivo gen analyssystem för att studera geners funktion önskvärt.
Tillämpningen av en överföring i vivo elektroporation-baserade gen system till hjärnans utveckling mus är lämplig för detta ändamål. I själva verket visat flera studier använder Utero elektroporation sin potential att göra funktionella analyser i den utvecklande hjärna1,2,3. Faktiskt, flera regioner i mus hjärnan, såsom cerebral cortex4, retina5, diencephalon6, hindbrain7, lillhjärnan8och ryggmärgen9 har varit föremål för somatisk gen leverans metoder, hittills.
Faktiskt, övergående genuttryck av i vivo elektroporation på embryonala mus hjärnor har länge använts för GOF analys. Senaste transposon-baserade genomisk integrationsteknik ytterligare aktiverat långsiktiga eller villkorliga uttrycket av gener av intresse10,11, vilket är fördelaktigt att dissekera genfunktion rumsliga och tidsmässiga tillfällen under utveckling. I motsats till GOF analys, har LOF analys varit mer utmanande. Medan övergående transfection av siRNAs och shRNA-carrying plasmider utfördes, garanteras långsiktiga effekter av LOF gener inte på grund av eventuell nedbrytning av exogent introducerade nucleic syror, såsom plasmider och dsRNAs. Den CRISPR/Cas-teknologin ger dock en break-through i LOF analyser. Gener som kodar för fluorescerande proteiner (t.ex., GFP) eller självlysande proteiner (t.ex., firefly luciferas) har transfekterats tillsammans med CRISPR-Cas9 och sgRNAs att märka cellerna exponeras för CRISPR-Cas9-medierad somatiska mutationer. Dock kan detta tillvägagångssätt ha begränsningar i funktionella studier på prolifererande celler, eftersom exogena markörgener är utspädd och förstörd efter långsiktig spridning. Medan de transfekterade cellerna och deras dotterceller genomgår CRISPR-inducerade mutationer i deras genom, kan deras fotspår gå förlorade över tid. Således, märkning metoder skulle vara lämpliga att övervinna problemet.
Vi har nyligen utvecklat en CRISPR-baserade LOF metod i lillhjärnan granule celler som genomgår långsiktig spridning under deras differentiering12. Etikettera genetiskt transfekterade cellerna, vi konstruerade en plasmid som bär en sgRNA tillsammans med Cre och införas i cerebella av Rosa26-CAG-LSL-Cas9-P2A-EGFP möss13 använda Utero elektroporation Plasmiden. Till skillnad från vanliga plasmid vektorer kodning andra, denna strategi framgångsrikt märkt transfekterade granule neuron prekursorer (BNI) och deras dotterceller. Denna metod ger bra stöd i förståelsen i vivo geners funktion av intresse i prolifererande celler i hjärnans normala utveckling och en tumör-benägen bakgrund.
Protocol
Representative Results
Discussion
Använda exo utero elektroporation, har vi tidigare rapporterat siRNA-baserade i vivo funktionella analyser av Atoh1 i ett tidigt skede av cerebellär granule cellen differentiering8. På grund av siRNA utspädning/nedbrytning och exponering av embryon utanför livmoderväggen var fenotypiska analys av electroporated granule celler begränsad till embryonala stadier. Men med den nuvarande metoden gjort analys av fenotypen av postnatal djur.
Vår tidiga…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi uppskattar Laura Sieber, Anna Neuerburg, Yassin Harim och Petra Schroeter för tekniskt bistånd. Vi tackar också Drs. K. Reifenberg, K. Dell och s. Prückl för bra stöd för djurförsök på DKFZ; den Imaging corefaciliteter från DKFZ och Carl Zeiss Imaging Center i DKFZ konfokalmikroskopi imaging. Detta arbete stöds av den Deutsche Forschungsgemeinschafts, KA 4472/1-1 (till D.K.).
Materials
| Alexa 488 Goat anti-Chicken | ThermoFisher | A11039 | 1:400 dilution |
| Alexa 568 Donkey anti-Mouse | Life Technologies | A-10037 | 1:400 dilution |
| Alexa 594 Donkey anti-Rabbit | ThermoFisher | A21207 | 1:400 dilution |
| Alexa 647 Donkey anti-Rabbit | Life Technologies | A31573 | 1:400 dilution |
| Alkaline Phosphatase (FastAP) | ThermoFisher | EF0654 | |
| Autoclave band | Kisker Biotech | 150262 | |
| BamHI (HF) | NEB | R3136S | |
| BbsI (FastDigest) | ThermoFisher | FD1014 | |
| Cellulose Filter Paper (Whatman) | Sigma-Aldrich | WHA10347525 | |
| Cloth | Tork | 530378 | |
| Confocal laser scanning microscope | Zeiss | LSM800 | |
| D-Luciferin | biovision | 7903-1 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | 1:1000 dilution |
| Disposable plastic molds (Tissue-Tek Cyromold) | VWR | 4566 | |
| DMEM Glutamax | ThermoFisher | 31966047 | |
| Donkey serum | Sigma-Aldrich | D9663 | |
| EcoRI (HF) | NEB | R3101S | |
| Electro Square Porator | BTX | ECM830 | |
| Endofree Maxi Kit | Qiagen | 12362 | |
| Ethanol | Merck | 107017 | |
| Eye ointment (Bepanthen) | Bayer | 81552983 | |
| Fast Green | Merck | 104022 | |
| FBS | ThermoFisher | 10270-016 | |
| Filter (0.22 µm) | Merck | F8148 | |
| Fluorescent cell imager (ZOE) | Biorad | 1450031 | |
| Forceps straight | Fine Science Tools | 91150-20 | |
| Gauze (X100 ES-pads 8f 10 x 10 cm) | Fisher Scientific | 15387311 | |
| GFP antibody | Abcam | ab13970 | 1:1000 dilution |
| Gibson Assembly Master Mix | NEB | E2611S | |
| Glass Capillary with Filament | Narishige | GD1-2 | |
| Heating Pad | ThermoLux | 463265 / -67 | |
| Image Processing software (ImageJ and Fiji) | NIH | – | |
| Insulin syringe (B. Braun OMNICAN U-100) | Carl Roth | AKP0.1 | |
| Isoflurane | Zoetis | TU061219 | |
| IVIS Lumina LT Series III Caliper | Perkin Elmer | CLS136331 | |
| Kalt Suture Needles | Fine Science Tools | 12050-02 | |
| KAPA HIFI HOTSTART READY mix | Kapa Biosystems | KK2601 | |
| Ki67 antibody | Abcam | ab15580 | 1:500 dilution |
| Light Pointer | Photonic | PL3000 | |
| Liquid blocker pen | Kisker Biotech | MKP-1 | |
| Metamizol | WDT | – | |
| Microgrinder | Narishige | EG-45 | |
| Microinjector | Narishige | IM300 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. | P-97 | |
| Microscope software ZEN | Zeiss | – | |
| Non-sterile Silk Suture Thread (0.12 mm) | Fine Science Tools | 18020-50 | |
| O.C.T. Compound (Tissue-Tek) | VWR | 4583 | |
| p27 antibody | BD bioscience | 610241 | 1:200 dilution |
| Paraformaldehyde | Roth | 335.3 | |
| PBS (1x) | Life Technologies | 14190169 | |
| pCAG-EGxxFP | Addgene | 50716 | |
| Polyethylenimine | Sigma-Aldrich | 408727 | |
| pX330 plasmid | Addgene | 42230 | |
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | |
| Quick Ligation Kit | NEB | M2200S | |
| Ring Forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | |
| Slides (SuperFrost) | ThermoFisher | 10417002 | |
| Software for biostatistics (Prism 7) | GraphPad Software, Inc | – | |
| Spitacid | EcoLab | 3003840 | |
| Stereomicroscope | Nikon | C-PS | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S5016 | |
| Surgical scissors | Fine Science Tools | 91460-11 | |
| Surgical scissors with blunt tip | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| Suture (Supramid schwarz DS 16, 1.5 (4/0)) | SMI | 220340 | |
| T4 DNA Ligation Buffer | NEB | B0202S | |
| T4 PNK | NEB | M0201S | |
| Tissue scissors Blunt (11.5 cm) | Fine Science Tools | 14072-10 | |
| TOP2B antibody | Santa Cruz | sc13059 | 1:200 dilution |
| Trypsin (2.5 %) | ThermoFisher | 15090046 | |
| Tweezers w/5mm Ø disk electrodes Platinum | Xceltis GmbH | CUY650P5 | |
| Vaporizer | Drägerwerk AG | GS186 |
Referências
- Mikuni, T., Nishiyama, J., Sun, Y., Kamasawa, N., Yasuda, R. High-Throughput, High-Resolution Mapping of Protein Localization in Mammalian Brain by In Vivo Genome Editing. Cell. 165 (7), 1803-1817 (2016).
- Zuckermann, M., Hovestadt, V., Knobbe-Thomsen, C. B., Zapatka, M., Northcott, P. A., Schramm, K., et al. Somatic CRISPR/Cas9-mediated tumour suppressor disruption enables versatile brain tumour modelling. Nat Commun. 6, 7391 (2015).
- Chen, F., Rosiene, J., Che, A., Becker, A., LoTurco, J. Tracking and transforming neocortical progenitors by CRISPR/Cas9 gene targeting and piggyBac transposase lineage labeling. Development. 142 (20), 3601-3611 (2015).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Developmental biology. 240 (1), 237-246 (2001).
- Matsuda, T., Cepko, C. L. Electroporation and RNA interference in the rodent retina in vivo and in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (1), 16-22 (2004).
- Matsui, A., Yoshida, A. C., Kubota, M., Ogawa, M., Shimogori, T. Mouse in utero electroporation: controlled spatiotemporal gene transfection. J Vis Exp. (54), (2011).
- Kawauchi, D., Taniguchi, H., Watanabe, H., Saito, T., Murakami, F. Direct visualization of nucleogenesis by precerebellar neurons: involvement of ventricle-directed, radial fibre-associated migration. Development. 133 (6), 1113-1123 (2006).
- Kawauchi, D., Saito, T. Transcriptional cascade from Math1 to Mbh1 and Mbh2 is required for cerebellar granule cell differentiation. Developmental biology. 322 (2), 345-354 (2008).
- Saba, R., Nakatsuji, N., Saito, T. Mammalian BarH1 confers commissural neuron identity on dorsal cells in the spinal cord. Journal of Neuroscience. 23 (6), 1987-1991 (2003).
- Sato, T., Muroyama, Y., Saito, T. Inducible gene expression in postmitotic neurons by an in vivo electroporation-based tetracycline system. J Neurosci Methods. 214 (2), 170-176 (2013).
- Kawauchi, D., Ogg, R. J., Liu, L., Shih, D. J. H., Finkelstein, D., Murphy, B. L., et al. Novel MYC-driven medulloblastoma models from multiple embryonic cerebellar cells. Oncogene. , (2017).
- Feng, W., Kawauchi, D., Korkel-Qu, H., Deng, H., Serger, E., Sieber, L., et al. Chd7 is indispensable for mammalian brain development through activation of a neuronal differentiation programme. Nat Commun. 8, 14758 (2017).
- Platt, R. J., Chen, S., Zhou, Y., Yim, M. J., Swiech, L., Kempton, H. R., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Joung, J., Konermann, S., Gootenberg, J. S., Abudayyeh, O. O., Platt, R. J., Brigham, M. D., et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout and transcriptional activation screening. Nat Protocols. 12 (4), 828-863 (2017).
- Cong, L., Ran, F. A., Cox, D., Lin, S., Barretto, R., Habib, N., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
- Mashiko, D., Fujihara, Y., Satouh, Y., Miyata, H., Isotani, A., Ikawa, M. Generation of mutant mice by pronuclear injection of circular plasmid expressing Cas9 and single guided RNA. Scientific Reports. 3, 3355 (2013).
- Gibson, D. G., Smith, H. O., Hutchison, C. A., Venter, J. C., Merryman, C. Chemical synthesis of the mouse mitochondrial genome. Nature. 7 (11), 901-903 (2010).
- Baumgart, J., Baumgart, N. Cortex-, Hippocampus-, Thalamus-, Hypothalamus-, Lateral Septal Nucleus- and Striatum-specific In Utero Electroporation in the C57BL/6 Mouse. J Vis Exp. (107), e53303 (2016).
- Martinez, S., Andreu, A., Mecklenburg, N., Echevarria, D. Cellular and molecular basis of cerebellar development. Frontiers in Neuroanatomy. 7, 18 (2013).
