Gel-seq: Een methode voor de voorbereiding van de bibliotheek van de gelijktijdige Sequencing van DNA en RNA met Hydrogel Matrices

Summary

Gel-seq kan onderzoekers gelijktijdig bereiden bibliotheken voor beide DNA – en RNA-seq op de te verwaarlozen extra kosten vanaf 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken.

Abstract

Alleen is er de mogelijkheid om te versterken en de opeenvolging van DNA of RNA van kleine startende steekproeven geboekt in de afgelopen vijf jaar. Helaas, de standaardprotocollen voor het genereren van genomic of transcriptomic bibliotheken stroken en onderzoekers moeten kiezen of u wilt de opeenvolging van DNA of RNA dat voor een bepaalde monster. Gel-seq is dit probleem opgelost doordat onderzoekers gelijktijdig voor te bereiden op bibliotheken zowel DNA en RNA beginnen met 100-1000 cellen met behulp van een eenvoudige hydrogel-apparaat. Dit document stelt een gedetailleerde aanpak voor de fabricage van zowel het apparaat als het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken. We ontworpen Gel-seq zo dat het eenvoudig konden worden geïmplementeerd door andere onderzoekers; vele genetica laboratoria hebben reeds de nodige apparatuur om te reproduceren van de Gel-seq apparaat fabricage. Ons protocol maakt gebruik van veelgebruikte kits voor beide geheel-transcript versterking (WTA) en voorbereiding van de bibliotheek, die ook kunnen worden vertrouwd voor onderzoekers reeds bedreven in genomic genereren en transcriptomic bibliotheken. Onze aanpak maakt het mogelijk onderzoekers aan het uitoefenen van de kracht van zowel DNA en RNA sequencing op één sample zonder splitsing en met te verwaarlozen extra kosten.

Introduction

Volgende generatie sequencing (NGS) heeft een diepgaande invloed gehad op de wijze genetica onderzoek wordt uitgevoerd. Waarin onderzoekers vooral eens gericht op rangschikkend het genoom van een hele diersoort, is het nu mogelijk om het genoom van een enkelvoudige tumor of zelfs een enkele cel in een experiment. ¹ NGS heeft ook het kosteneffectief te sequentie van het RNA afschriften gevonden binnen een cel, een verzameling gegevens die als een transcriptome wordt bekend. Alleen is er de mogelijkheid om te versterken en de opeenvolging van DNA of RNA van kleine startende steekproeven geboekt in de afgelopen vijf jaar. ^{2 , 3 , 4} helaas standaard protocollen zijn niet compatibel en onderzoekers moeten kiezen of u wilt de opeenvolging van DNA of RNA dat voor een gegeven steekproef. Wanneer een eerste steekproef groot genoeg is, kan het in tweeën worden gesplitst. Op kleinere schalen, echter verlies van materiaal als gevolg van splitsing van monsters kan invloed hebben op de kwaliteit van de bibliotheek, en bundeling van monsters kan gemiddelde uit interessante verschillen tussen cellen. ⁵ voorts onderzoekers zijn steeds meer geïnteresseerd in het onderzoek van de monsters die niet kunnen worden gesplitst, zoals afzonderlijke cellen of kleine heterogene tumor biopsieën. ⁶

Om aan te pakken dit probleem, drie protocollen zijn onlangs ontwikkeld om zowel DNA en RNA van hetzelfde uitgangspunt monster volgnummer: Gel-seq⁷, G & T-seq⁸pt⁹van de DR-seq. Dit artikel presenteert een gedetailleerd protocol voor Gel-seq, die kan worden gebruikt om gelijktijdig het genereren van DNA en RNA bibliotheken uit zo weinig als 100 cellen op de te verwaarlozen extra kosten. De roman aspect van Gel-seq is de capaciteit om DNA en RNA uitsluitend gebaseerd op grootte met behulp van low-cost hydrogel matrices te scheiden. De innovatie van de kern van het Gel-Seq-protocol is de fysieke scheiding van DNA van RNA. Deze scheiding wordt bereikt electrophoretically met behulp van een combinatie van polyacrylamide membranen die van de verschillen van grootte tussen deze moleculen profiteren. Om deze grootte verschillen in context, overwegen hoe DNA en RNA zijn beeld: terwijl DNA op de micron-schaal bestaat en kan bekeken worden met behulp van traditionele microscopen, RNA bestaat op de nanometerschaal en moet worden beeld met behulp van complexe technieken zoals cryo-elektron microscopie. ¹⁰

De aanpak van het scheiden van DNA en RNA in dit protocol is afgebeeld in Figuur 1. Het linker paneel toont DNA en RNA vrij zwevend in de oplossing in de buurt van een membraan. Wanneer een elektrisch veld wordt toegepast, zoals wordt weergegeven in het rechter paneel, ervaring DNA en RNA een elektroforetisch kracht die induceert van migratie door het membraan. Door de eigenschappen van de membraan tuning, hebben we een semi-permeabel membraan die scheidt van DNA van RNA. De DNA moleculen zijn tegen het membraan geduwd, maar geraakt aan de rand vanwege hun grote omvang. Kleine molecules van RNA, aan de andere kant, kunnen configureren en weven hun weg door het membraan. Dit proces, bekend als reptation, is vergelijkbaar met de manier waarop die een slang door gras beweegt. Uiteindelijk deze RNA-moleculen worden gestopt door een tweede, high-density membraan, dat is te moeilijk voor zelfs kleinere polymeren (> 200 basenparen) te onderuit door. Zodra fysiek gescheiden, kan DNA en RNA worden hersteld en verwerkt voor het genereren van informatie over zowel het genoom en de transcriptome. Terwijl we DNA en RNA scheiden kunt, hebben we vonden betere resultaten worden verkregen als de RNA via reverse wordt-herschreven als cDNA vóór scheiding. De cDNA/RNA-hybriden zijn stabieler dan RNA alleen en kunnen nog aan de lage dichtheid membraan passeren.

Figuur 1 . Gel-seq operationele principe. Het onderliggende principe gebruikt voor fysiek gescheiden van DNA en RNA. In een toegepast elektrisch veld, kleine molecules van RNA worden gemigreerd door de lage dichtheid membraan maar grote DNA moleculen zitten op het oppervlak. Dit cijfer was van Ref. 7 gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Deze paper beschrijft in detail zowel de fabricage van de Gel-seq-apparaat en het biologische protocol voor het genereren van gepaarde bibliotheken van DNA en RNA. Een overzicht van beide is afgebeeld in Figuur 2. Het apparaat is vervaardigd door gelaagdheid drie verschillende dichtheid polyacrylamide gels boven op elkaar in een proces gelijkend op het maken van standaard stapelvolgorde gels. ¹¹ het biologische protocol begint met 100-1000 cellen gesuspendeerd in PBS. De cellen zijn lysed en RNA wordt omgezet in cDNA voordat het apparaat wordt gebruikt om te scheiden van de genomic DNA van de cDNA/RNA hybriden. Na de scheiding en terugwinning, genomic en transcriptomic zijn bibliotheken opgesteld op basis van een proces dat volgt op het geheel-genoom-standaardbibliotheek voorbereiding kit protocol. Verdere details over de ontwikkeling en validatie van Gel-seq kan worden gelezen in het Lab op een Chip publicatie “Gel-seq: geheel-genoom en de sequencing van de transcriptome door gelijktijdige lage-input DNA en RNA bibliotheek voorbereiding met behulp van semi-permeabel hydrogel belemmeringen .” ⁷

Figuur 2 . Gel-seq Protocol. Een overzicht van de stappen voor het fabriceren van het Gel-seq-apparaat en het protocol bij gegenereerde gepaarde DNA en RNA bibliotheken. Gedeelten van dit cijfer waren van Ref. 7 gereproduceerd met toestemming van de Royal Society of Chemistry. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.

Voor het genereren van DNA en RNA bibliotheken van afzonderlijke cellen, onderzoekers overwegen G & T-seq of DR-seq. G & T-Seq, zoals Gel-seq te gebruiken, is afhankelijk van een fysieke scheiding van RNA van genomic DNA. Deze aanpak berust op messenger RNA (mRNA) 3 ‘ polyadenylated staart als een pull-down-doel. De mRNA wordt vastgelegd op een magnetische kraal met behulp van een biotinyleerd oligo-dT primer. Zodra het mRNA is gevangen de kralen zijn met een magneet op zijn plaats gehouden en het supernatant met de genomic DNA kan worden verwijderd en kan worden overgedragen aan een andere buis. Na deze fysieke scheiding voltooid is, kunnen de aparte bibliotheken worden gegenereerd vanuit de mRNA en DNA. ⁸ deze aanpak werkt goed als het RNA van belang polyadenylated, nochtans niet het worden gebruikt om te studeren van afschriften van de niet-polyadenylated, zoals ribosomaal RNA, tRNA, of RNA van prokaryoten.

DR-seq is afhankelijk van een versterking van de pre-stap waar zowel DNA en cDNA afgeleid van RNA worden versterkt in de dezelfde buis. Het monster wordt vervolgens in tweeën gesplitst en verwerkt parallel aan het bereiden van DNA – en RNA-seq bibliotheken. Om deze te onderscheiden van genomic DNA en cDNA afgeleid van RNA, neemt DR-seq een rekenkundige benadering. Sequenties waar alleen exons aanwezig zijn worden rekenkundig onderdrukt in de genomic DNA-gegevens, zoals die zou zijn ontstaan van DNA of RNA. ⁹ een voordeel van deze aanpak is dat het DNA en cDNA/RNA niet worden fysiek gescheiden moeten zoals is gedaan in Gel-seq en G & T-seq. Het nadeel is echter dat DR-seq een priori kennis van het genoom en de transcriptome (d.w.z., exons en introns vereist), en niet ideaal voor toepassingen zoals het rangschikken van kernen wellicht, waarin vele transcripties nog niet volledig zijn verbinding aan de randen en bevatten nog steeds introns. ¹²

De roman aspect van Gel-seq is de mogelijkheid om te scheiden van DNA en RNA in honderden cellen uitsluitend gebaseerd op grootte. Deze methode vereist geen a priori kennis van het genoom- of transcriptome, is robuust tegen onvolledig splicing, en is niet beperkt tot de afschriften van de poly-adenylated. Voor toepassingen waar een onderzoeker met ten minste 100 cellen beginnen kan, biedt Gel-seq een eenvoudige aanpak met behulp van goedkope en wijd-beschikbare materialen.

Protocol

1. chemische oplossing voorbereiding Opmerking: De volgende stappen zijn voor het voorbereiden van chemische oplossingen in latere stappen vereist. Deze kunnen worden gemaakt in bulk en opgeslagen voor enkele maanden. Om te beginnen, bereid u 50 mL zuivere, gedeïoniseerd water door het steriliseren in een 254 nm UV crosslinking oven gedurende 15 minuten (15 mJ/cm2 totale blootstelling) te neutraliseren van eventuele contaminerende DNA. Verwarm tot 37 ° C voor gebruik in …

Representative Results

De fysieke scheiding van gDNA en cDNA/RNA hybriden in de Gel-seq-apparaat kan worden gevisualiseerd door middel van fluorescerende gel imaging; een representatief resultaat is afgebeeld in Figuur 3. Paneel A toont het verzonnen Gel-seq-apparaat; foute kleuren is toegevoegd om te onderscheiden van de verschillende gel-regio’s. Paneel B toont een close up van vier verschillende kleurscheidingen gebruikt voor validatie. De derde rijstrook, een negatieve controle…

Discussion

Er zijn verschillende kritische stappen die zijn gekoppeld aan de Gel-seq apparaat fabricage, alsmede het protocol zelf. Tijdens fabricage, is het raadzaam te beginnen met de voorgeschreven laagdiktes voor de verschillende regio’s van de gel. We tijd aanzienlijke testen verschillende fabricage opties en het protocol hier beschreven produceert de beste apparaten voor de cassettes vermeld in de tabel van materialen en reagentia. Als onderzoekers een alternatieve cassette systeem gebruiken, kunnen zij vinde…

Materials

Reagents
Acrylamide Monomer	Sigma Aldrich	A8887-100G
Ammonium Persulfate	Sigma Aldrich	A3678-25G
Ampure XP Beads	Beckman Coulter	A63880	Referred to in the text as solid phase reversible immobilization (SPRI) beads
DNA Gel Loading Dye (6x)	ThermoFisher Scientific	R0611	Referred to in the text as 6X loading dye
Ethyl alcohol	Sigma Aldrich	E7023-500ML
KAPA SYBR FAST One-Step qRT-PCR Kits	Kapa BioSystems	7959613001	Referred to in the text as 2X qPCR mix
N,N′-Methylenebis(acrylamide)	Sigma Aldrich	146072-100G	Also known as bis-acrylamide
NexteraXT DNA Library Preparation Kit (referred to in the text as library preparation kit)	Illumina	FC-131-1024	Includes: TD (referred to in the text as transposase buffer), ATM (referred to in the text as transposase), NT (referred to in the text as transposase stop buffer), and NPM (Referred to in the text as library prep PCR mix)
Nuclease Free Water	Millipore	3098
Protease	Qiagen	19155
SMART-Seq v4 Kit (referred to in the text as whole-transcript amplification (WTA) kit)	Takara/Clontech	634888	Includes: Lysis buffer, RNase inhibitor, 3’ SMART-Seq CDS Primer II A (referred to in the text as RT primer), 5X Ultra Low First Strand Buffer (referred to in the text as first strand buffer), SMART-Seq v4 Oligonucleotide (referred to in the text as template switch oligonucleotide (TSO)), SMART-Scribe Reverse Transcriptase (referred to in the text as reverse transcriptase), and PCR Primer II A (referred to in the text as cDNA PCR primer)
Random hexamer with WTA adapter	IDT	n/a	5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC-NNNNNN-3′
Sucrose	Sigma Aldrich	S0389-500G
TEMED	Sigma Aldrich	T9281-25ML
DNA AWAY Surface Decontaminant	ThermoFisher Scientific	7010PK	Referred to in the text as DNA removal product
Tris-Borate-EDTA buffer (10X concentration)	Sigma Aldrich	T4415-1L
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000X Concentrate in DMSO)	ThermoFisher Scientific	S11494	Referred to in the text as gel stain
Equipment
BD Precisionglide syringe needles, gauge 18	Sigma Aldrich	Z192554	Any equivalent hardware is acceptable
Branson CPX series ultrasonic bath	Sigma Aldrich	Z769363	Any equivalent hardware is acceptable
Empty Gel Cassettes, mini, 1.0 mm	ThermoFisher Scientific	NC2010	Any equivalent hardware is acceptable
Mesh Filter Plate – Corning HTS Transwell 96 well permeable supports – 8.0 µm pore size	Sigma Aldrich	CLS3374	Referred to in the text as 8 um mesh filter plate
PowerPac HC Power Supply	Bio-Rad	1645052	Any equivalent hardware is acceptable
Qubit Fluorometer	ThermoFisher Scientific	Q33216	Any equivalent hardware is acceptable
Vacufuge Concentrator	Eppendorf	22822993	Any equivalent hardware is acceptable
XCell SureLock Mini-Cell system	ThermoFisher Scientific	EI0001	Any equivalent hardware is acceptable
Bio-Rad CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System	Bio-Rad	1855195	Any equivalent hardware is acceptable
Amersham UVC 500 Ultraviolet Crosslinker	GE Healthcare Life Sciences	UVC500-115V	Discontinued, any equivalent hardware is acceptable
Gel Doc XR+ Gel Documentation System	Bio-Rad	1708195	Referred to in the text as gel imager
Dark Reader Transilluminator	Clare Chemical Research	DR89	Referred to in the text as UV transilluminator
Ultrasonic Bath	Bransonic	1207K35	Any equivalent ultrasonic bath is acceptable.