Belysning opp veier å Caspase aktivisering med resultatet av dette fluorescens Complementation
Summary
Denne protokollen beskriver caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC); en imaging-basert metode som kan brukes til å visualisere indusert nærhet av initiatoren caspases, som er det første trinnet i aktivisering.
Abstract
Caspase familien til proteaser spille viktige roller i apoptose og medfødt immunitet. Blant disse er en undergruppe kalles initiator caspases de første være aktivert på disse veiene. Denne gruppen omfatter caspase-2,-8, og-9, samt den inflammatoriske caspases, caspase-1-4, og-5. Initiatoren caspases aktiveres alle som dimerization etter rekruttering til bestemte multiprotein komplekser kalt aktivisering plattformer. Caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC) er en bildebehandling tilnærming der delt fluorescerende proteiner smeltet til initiativtakeren caspases brukes til å visualisere rekruttering av initiatoren caspases deres aktivisering plattformer og den resulterende indusert nærhet. Denne fluorescens gir en presentasjon av en av de tidligste trinnene som kreves for initiatoren caspase aktivisering. Bruker en rekke ulike mikroskopi-baserte tilnærminger, kan denne teknikken gi kvantitative data om effektiviteten av caspase aktivisering opp på en befolkningsnivå samt kinetics størrelse og antall caspase aktivere caspase aktivisering komplekser på per celle basis.
Introduction
Caspase protease familien er kjent for sin avgjørende roller i apoptose og medfødt immunitet 1. På grunn av deres betydning, avgjøre når, hvor og hvor effektivt bestemte caspases aktiveres kan gi viktig innsikt i mekanismer for caspase aktivisering trasé. Den tenkelig basert protokollen beskrevet her kan effekten av de tidligste trinnene i caspase aktivisering kaskade. Denne teknikken utnytter dynamisk protein: protein interaksjoner som stasjonen caspase aktivisering.
I caspases kan deles inn i to grupper: initiator-caspases (caspase-1, -2, -4, 5,-8,-9, -10 og -12) og bøddelen caspases (caspase-3-6 og -7). Bøddelen caspases finnes i cellen som preformed dimers og aktiveres som spalting mellom store og små delenhet 2. Når aktivert, hveran mange strukturelle og regulatoriske proteiner som resulterer i apoptose 3. Initiator-caspases er det første caspases aktiveres i en sti og generelt utløse aktivering av bøddelen caspases. I motsetning til bøddelen caspases aktiveres initiatoren caspases som dimerization 4,5. Denne dimerization er tilrettelagt av rekruttering av inaktive monomerer til bestemte store molekylvekt komplekser kalles aktivisering plattformer. Montering av aktivisering er underlagt en rekke bestemt protein: protein interaksjoner. Disse er formidlet av bevarte protein samhandling motiver i den proform av initiatoren caspase og inkluderer død domene (DD), død effektor domene (DED) og caspase rekruttering domene (kort) 6 (figur 1A). Aktivisering plattformer inkluderer vanligvis en reseptor protein og en adapter protein. Reseptoren aktiveres vanligvis ved binding av en ligand, indusere en conformational endring som tillater oligomerization av mange molekyler. Reseptoren deretter rekrutter enten til caspase direkte eller adapter molekyler som igjen bringer caspase til komplekset. Dermed kommer mange caspase molekyler i nærheten tillater dimerization. Dette kalles indusert nærhet modell 7. Når dimerized, gjennomgår caspase autoprocessing, som serverer å stabilisere aktiv enzym 4,8. For eksempel er montering av den Apaf1 apoptosome utløst av cytochrome c etter utgivelsen fra mitokondrier i en prosess som kalles mitokondrie ytre membran permeabilization (MOMP). Apaf1 rekrutterer igjen caspase-9 til en samhandling som er formidlet av et kort i begge proteiner 9. Lignende protein interaksjoner resultat i samlingen CD95 død inducing signalering komplekse (plate) som fører til caspase-8 aktiveringen. PIDDosome, som kan aktivere caspase-2; og ulike inflammasome komplekser som starter caspase-1 aktivering 10,11,12. Dermed er initiatoren caspases rekruttert til bestemte aktivisering plattformer av en felles mekanisme indusert nærhet og dimerization, uten noe som ikke skjer aktivisering.
Caspase resultatet av dette fluorescens Complementation (BiFC) er en bildebehandling-basert analyse som ble utviklet for å måle denne steg for aktivering av initiatoren caspases, slik at direkte visualisering av caspase indusert nærhet etter aktivisering plattform montering. Denne metoden tar fordel av egenskapene til split fluorescerende protein Venus. Venus er en lysere og mer photostable versjon av gule fluorescerende protein (YFP) som kan deles inn i to ikke-fluorescerende og litt overlappende fragmenter: N-terminus Venus (Venus N eller VN) og C-terminus Venus (Venus C eller VC). Disse fragmentene beholder refold og bli fluorescerende i nærheten 13. Hver Venus fragment er del av prodomain av caspase, som er den minimale delen av caspase som binder aktivisering-plattformen. Dette sikrer at caspases beholder ikke enzymatisk aktivitet og derfor samtidige analyse av nedstrøms hendelser knyttet endogene hendelser er mulig. Venus fragmenter refold når caspase prodomains rekrutteres aktivisering-plattformen og gjennomgå indusert nærhet. (Figur 1B). Den resulterende Venus fluorescensen kan brukes til nøyaktig og spesielt overvåke den subcellular lokaliseringen, kinetics og effektiviteten av montering av initiatoren caspase aktivisering plattformer i enkeltceller. Bildebehandling data kan skaffes ved AC confocal mikroskopi eller standard fluorescens mikroskopi og kan tilpasses mange forskjellige mikroskopi tilnærminger inkludert: time-lapse imaging for å spore caspase aktivisering i sanntid; Høyoppløselig bilde for presise avgjørelser av subcellular lokalisering; og sluttpunkt kvantifisering av effektiviteten av aktivisering.
Denne teknikken ble først utviklet for å undersøke aktivering av caspase-214. Mens aktivering plattformen for caspase-2 antas å være PIDDosome, bestående av reseptoren PIDD (p53-indusert protein med et død domene) og adapter RAIDD (RIP-assosiert ICH-1/CAD-3 homologe protein med en død-domene), PIDDosome-uavhengig caspase-2 aktivisering er rapportert. Dette tyder på at ekstra aktivering plattformer for caspase-2 finnes 15,16. Til tross for ikke å vite full komponentene i caspase-2 aktivisering plattformen, har caspase BiFC teknikken tillatt for vellykket avhør av caspase-2-signalveier på molekylært nivå 14,–17. Vi har også lykkes tilpasset denne protokollen for den inflammatoriske caspases (caspase-1-4, 5 og -12) 18 og i prinsippet den samme tilnærmingen bør være tilstrekkelig tilsvarende analysere hver av de gjenværende initiatoren caspases. Denne protokollen kan tilsvarende tilpasses å undersøke andre veier ble dimerization er store aktivering signal. For eksempel er STAT proteiner aktivert ved dimerization etter fosforylering av Janus kinase (JAK) 19. Dermed kan BiFC systemet brukes til å visualisere for STAT aktivisering, samt mange andre baner regulert av dynamisk protein interaksjoner. Følgende protokollen gir trinnvise instruksjoner for innføring av journalister i celler og metoder for bildeopptak og analyse.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne protokollen omhandler bruk av delt fluorescerende proteiner måle caspase indusert nærhet. Split Venus ble valgt for denne teknikken fordi det er svært lyse, svært photostable og den refolding er rask 13. Dermed kan analyse av Venus refolding på caspase indusert nærhet gi nær sanntid beregninger av caspase protein samhandling dynamics. Venus er delt inn i to litt overlappende fragmenter, N endestasjonen til Venus (Venus-N eller VN) bestående av aminosyrer 1-173 og C terminalen fragmen…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi ønsker å anerkjenne alle tidligere medlemmer av Bouchier-Hayes laboratoriet som bidro til utviklingen av denne teknikken. Dette arbeidet ble finansiert delvis av en Texas Children’s Hospital Pediatric Pilot prisen til LBH. Vi takker Joya Chandra (MD Anderson, Houston, Texas) for tillatelse til å inkludere data publisert i samarbeid med gruppen. Utviklingen av reagensene beskrevet ble støttet av cytometri og celle sortering kjernen ved Baylor College of Medicine med finansiering fra NIH (NIAID P30AI036211 NCI P30CA125123 og NCRR S10RR024574) og hjelp av Joel M. Sederstrom
Materials
| 6-well Uncoated No. 1.5 20 mm glass bottom dishes | Mattek | P06G-1.5-20-F | |
| Human Plasma Fibronectin Purified Protein | Millipore | FC010-10MG | |
| DPBS | Sigma | D8537-6x500ML | |
| Lipofectamine 2000 reagent | Invitrogen | 11668019 | |
| OPTI MEM I | Invitrogen | 31985088 | |
| C2-Pro VC plasmid | Addgene | 49261 | |
| C2-Pro VN plasmid | Addgene | 49262 | |
| Inflammatory caspase BiFC plasmids | available by request from LBH | ||
| HeLa cells stably expressing the C2-Pro BiFC components | available by request from LBH | ||
| DsRed mito plasmid | Clontech | 632421 | similar plasmids that can be used as fluorescent reporters can be found on Addgene |
| HEPES | Invitrogen | 15630106 | |
| 2 Mercaptoethanol 1000X | Invitrogen | 21985023 | |
| q-VD-OPH | Apex Bio | A1901 |
Referências
- Salvesen, G. S., Riedl, S. J. Caspase mechanisms. Adv Exp Med Biol. 615, 13-23 (2008).
- Boatright, K. M., Salvesen, G. S. Mechanisms of caspase activation. Curr Opin Cell Biol. 15 (6), 725-731 (2003).
- Luthi, A. U., Martin, S. J. The CASBAH: a searchable database of caspase substrates. Cell Death Differ. 14 (4), 641-650 (2007).
- Baliga, B. C., Read, S. H., Kumar, S. The biochemical mechanism of caspase-2 activation. Cell Death Differ. 11 (11), 1234-1241 (2004).
- Boatright, K. M., et al. A unified model for apical caspase activation. Mol Cell. 11 (2), 529-541 (2003).
- Aravind, L., Dixit, V. M., Koonin, E. V. The domains of death: evolution of the apoptosis machinery. Trends Biochem Sci. 24 (2), 47-53 (1999).
- Salvesen, G. S., Dixit, V. M. Caspase activation: the induced-proximity model. Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (20), 10964-10967 (1999).
- Oberst, A., et al. Inducible dimerization and inducible cleavage reveal a requirement for both processes in caspase-8 activation. J Biol Chem. 285 (22), 16632-16642 (2010).
- Riedl, S. J., Salvesen, G. S. The apoptosome: signalling platform of cell death. Nat Rev Mol Cell Biol. 8 (5), 405-413 (2007).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO J. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Martinon, F., Burns, K., Tschopp, J. The inflammasome: a molecular platform triggering activation of inflammatory caspases and processing of proIL-beta. Mol Cell. 10 (2), 417-426 (2002).
- Tinel, A., Tschopp, J. The PIDDosome, a protein complex implicated in activation of caspase-2 in response to genotoxic stress. Science. 304 (5672), 843-846 (2004).
- Shyu, Y. J., Liu, H., Deng, X., Hu, C. D. Identification of new fluorescent protein fragments for bimolecular fluorescence complementation analysis under physiological conditions. Biotechniques. 40 (1), 61-66 (2006).
- Bouchier-Hayes, L., et al. Characterization of cytoplasmic caspase-2 activation by induced proximity. Mol Cell. 35 (6), 830-840 (2009).
- Manzl, C., et al. Caspase-2 activation in the absence of PIDDosome formation. J Cell Biol. 185 (2), 291-303 (2009).
- Manzl, C., et al. PIDDosome-independent tumor suppression by Caspase-2. Cell Death Differ. 19 (10), 1722-1732 (2012).
- Ando, K., et al. NPM1 directs PIDDosome-dependent caspase-2 activation in the nucleolus. J Cell Biol. , (2017).
- Sanders, M. G., et al. Single-cell imaging of inflammatory caspase dimerization reveals differential recruitment to inflammasomes. Cell Death Dis. 6, e1813 (2015).
- Aaronson, D. S., Horvath, C. M. A road map for those who don’t know JAK-STAT. Science. 296 (5573), 1653-1655 (2002).
- Manton, C. A., et al. Induction of cell death by the novel proteasome inhibitor marizomib in glioblastoma in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 18953 (2016).
- Fan, J. Y., et al. Split mCherry as a new red bimolecular fluorescence complementation system for visualizing protein-protein interactions in living cells. Biochem Biophys Res Commun. 367 (1), 47-53 (2008).
- Chu, J., et al. A novel far-red bimolecular fluorescence complementation system that allows for efficient visualization of protein interactions under physiological conditions. Biosens Bioelectron. 25 (1), 234-239 (2009).
- Karbowski, M., Youle, R. J. Dynamics of mitochondrial morphology in healthy cells and during apoptosis. Cell Death Differ. 10 (8), 870-880 (2003).
- Proell, M., Gerlic, M., Mace, P. D., Reed, J. C., Riedl, S. J. The CARD plays a critical role in ASC foci formation and inflammasome signalling. Biochem J. 449 (3), 613-621 (2013).
- Szymczak, A. L., Vignali, D. A. Development of 2A peptide-based strategies in the design of multicistronic vectors. Expert Opin Biol Ther. 5 (5), 627-638 (2005).
- Chang, D. W., Xing, Z., Capacio, V. L., Peter, M. E., Yang, X. Interdimer processing mechanism of procaspase-8 activation. EMBO J. 22 (16), 4132-4142 (2003).
- Stennicke, H. R., et al. Caspase-9 can be activated without proteolytic processing. J Biol Chem. 274 (13), 8359-8362 (1999).
- Slee, E. A., et al. Ordering the cytochrome c-initiated caspase cascade: hierarchical activation of caspases-2, -3, -6, -7, -8, and -10 in a caspase-9-dependent manner. J Cell Biol. 144 (2), 281-292 (1999).
- McStay, G. P., Salvesen, G. S., Green, D. R. Overlapping cleavage motif selectivity of caspases: implications for analysis of apoptotic pathways. Cell Death Differ. 15 (2), 322-331 (2008).
