הקרנה מבוססת תא מאתר הלבלב איון Diabetogenic כימיקלים סביבתיים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאי הלבלב איון העכבר לסינון את inductions ROS מאת ואינטראקציות על מנת לזהות פוטנציאל diabetogenic xenobiotic כימיקלים.
Abstract
חשיפה לכימיקלים סביבתיים מסוימים של האדם ובעלי חיים נמצאה לגרום נזק תאי של תאי β בלבלב אשר יוביל להתפתחות של סוכרת סוג 2 (T2DM). למרות המנגנונים על הנזק תאי β כימית-induced היה לא ברור, עשוי להיות מורכב, ממצא חוזרות אחד היא כי חומרים אלה זירוז סטרס חמצוני שמוביל הדור של מינים חמצן תגובתי מוגזמת (ROS) לגרום נזק התא β. כדי לזהות פוטנציאל diabetogenic כימיקלים סביבתיים, בודדנו תאי הלבלב איון של עכברים C57BL/6 ואיון בתרבית תאים ב 96-ובכן תא תרבות לוחות; לאחר מכן, התאים איון היו עצומות עם כימיקלים, הדור ROS אותרה על ידי 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCFH-DA) הפלורסנט. באמצעות שיטה זו, אנו נמצא כי ביספנול A (BPA), Benzo [א] pyrene (BaP) ולאחר polychlorinated biphenyls (PCBs), עלול לגרום לרמות גבוהות של ROS, רומז כי הם פוטנציאלי עלול לגרום נזק תאי איון. שיטה זו צריכה להיות שימושית עבור הקרנת diabetogenic ואינטראקציות. בנוסף, התאים בתרבית איון עשוי גם להיות מותאם לניתוח במבחנה רעילות כימית-induced בתאי הלבלב.
Introduction
עולה השכיחות של T2DM הפכו משבר הבריאות העולמי בשנים האחרונות פוזות איום רציני לבריאות הציבור1. גורמים רבים נמצאו להיות מקושר סיבתי הפיתוח של T2DM, ביניהם, חוזרות ממצאים מראים כי נקודה מתכנסת אחת נפוצה עבור גורמים אלה הוא אינדוקציה של סטרס חמצוני, מה שמוביל הדור של ROS מופרז2 , 3.
מגוון רחב של כימיקלים סביבתיים לרבות Pcb, דיוקסינים BaP נמצאה לזירוז סטרס חמצוני, אשר עלול לפגום את תפקוד תאי β בלבלב, להוביל תנגודת לאינסולין ו- T2DM4. למרות הרמה פיזיולוגיים של ROS ממלא תפקיד חשוב בתאיים, חשיפה ROS שחורג הקיבולת של המערכת נוגד חמצון מתבטא הנזק לרקמות/תאים ומוביל מחלות5. תאי β בלבלב אקספרס רמה נמוכה של אנזימים נוגדי חמצון, ולכן הם מטרה רגיש ביותר נזק בתיווך סטרס חמצוני6,7. חשיפה כרונית רמות גבוהות של ROS הוכח לגרום תאי הלבלב מפגינות תפקוד5 וכן לאינסולין בכבד, רקמת שומן8.
המטרה הכוללת של הפרויקט הזה היא לפתח הנועד מבוססת תא כימיקלים המסך שלהם פוטנציאל diabetogenic מבוסס על אינדוקציה שלהם של ROS בתאי הלבלב. הלבלב חסר רעלים מטבוליים, הוא מטרה רגיש הנזק הנגרמת xenobiotic6,7. לכן, על ידי מדידת ישירות את האבחון שנוצר בתאי הלבלב, וזמינותו הזה צריך לספק הערכה ישירה של הפגיעה הנגרמת כימית בלבלב. כדי לפתח שיטה זו, אנחנו מבודדים לנגרהנס עכבר תרבותי של איון מבודד בתנאי התרבות תאים עם כימיקלים, מנוצל הדור ROS כימית-induced כמו המדידה. ההליך זה פשוטה ויעילה בזיהוי בתדר ROS חומרים כימיים איון מבודדים; זה יכול להיות פיתוח נוסף לחקירה על מנגנוני רעילות ספציפיים הלבלב חוץ גופית בתוך.
Protocol
Representative Results
Discussion
לצבירת ראיות מציע כי החשיפה לכימיקלים סביבתיים ממלא תפקיד חשוב בהתפתחות של T2DM. ROS ואינטראקציות-induced הוכר כגורם etiological פוטנציאליים, תורם להתפתחות של T2DM. בני אדם חשופים למגוון רחב של כימיקלים xenobiotic, ויש צורך גדול עבור מחקר חדשניים טכניקות לזיהוי ביעילות את הלבלב חשיפה לרעלים, לחקור את המנגנו?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענק הפרויקט טייס ממרכז CREH ממומן על ידי NIEHS ועל ידי הלאומי מדעי הטבע קרן של סין (מספר 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
Referências
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
