En Murine bukspyttkjertelen Holme celle-basert Screening for Diabetogenic miljø kjemikalier
Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere musen bukspyttkjertelen Holme celler for screening på inductions ROS av xenobiotics for å identifisere potensielle diabetogenic xenobiotic oval kjemikalier.
Abstract
Eksponering for visse miljømessige kjemikalier i menneske og dyr har funnet cellular skade bukspyttkjertelen β cellene som vil føre til utvikling av type 2 diabetes mellitus (T2DM). Selv om mekanismene for kjemisk-indusert β celleskader var uklart og sannsynlig å bli komplekse, er en regelmessig finne at disse kjemikaliene induserer oksidativt stress fører til generering av overdreven reaktive oksygen arter (ROS) som induserer skade β cellen. For å identifisere potensielle diabetogenic miljømessige kjemikalier, isolerte vi bukspyttkjertelen Holme cellene fra C57BL/6 mus og kultivert Holme i 96-brønnen celle kultur platene. deretter Holme cellene var dosert med kjemikalier og ROS generasjon ble oppdaget av 2′, 7′-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescerende fargestoff. Bruker denne metoden, vi fant at bisphenol A (BPA), Benzo [a] pyrene (BaP) og polyklorerte bifenyler (PCB), kan føre til høye nivåer av ROS, tyder på at de kan potensielt forårsake skade i Holme celler. Denne metoden bør være nyttig for screening diabetogenic xenobiotics. I tillegg kan kulturperler Holme cellene også være tilpasset i vitro analyse av kjemiske-indusert toksisitet i bukspyttkjertelen celler.
Introduction
Økning i utbredelsen av T2DM har blitt en global helse-krise i årene utgjør en alvorlig trussel mot folkehelsen1. Mange faktorer er funnet å være causally knyttet til utviklingen av T2DM, blant annet, regelmessige funn tyder på at en vanlig konvergent punkt for disse faktorene er induksjon av oksidativt stress som fører til generasjon av overdreven ROS2 , 3.
Et bredt spekter av miljømessige kjemikaliene som PCB, dioksiner og BaP har blitt funnet for å indusere oksidativt stress, som kan forringe funksjonen i bukspyttkjertelen β celler og føre til insulinresistens og T2DM4. Selv om hvilket fysiologiske ROS spiller en viktig rolle i cellulære funksjoner, eksponering for ROS som overstiger kapasiteten av antioksidant resulterer i skade celler/vev og fører til sykdommer5. Bukspyttkjertelen β celler uttrykke lave antioksidant enzymet, og dermed er en følsom mål for oksidativt stress-mediert skade6,7. Kronisk eksponering for høye nivåer av ROS har vist seg å forårsake stress-indusert bukspyttkjertelen celle dysfunksjon5 og insulinresistens i lever og fettvev8.
Det overordnede målet med dette prosjektet er å utvikle et cellebasert analysen skjermen kjemikalier for deres diabetogenic potensialer basert på deres induksjon av ROS i bukspyttkjertelen celler. Bukspyttkjertelen mangler metabolske avgiftning og er en følsom mål for xenobiotic oval-indusert skade6,7. Derfor ved å måle direkte ROS generert i bukspyttkjertelen celler, bør denne analysen gi en direkte tilnærming til kjemisk-indusert skaden i bukspyttkjertelen. For å utvikle denne metoden, vi isolert musen bukspyttkjertelen holmer, kultivert isolert Holmen under celle kultur tilstand med kjemikalier og anvende den kjemiske-indusert ROS generasjonen som er avlesning. Denne prosedyren er enkel og effektiv identifisering ROS-inducing kjemikalier i isolerte Holmen; Det kan utvikles for undersøkelse av mekanismer toksisitet som gjelder for bukspyttkjertelen i vitro.
Protocol
Representative Results
Discussion
Samler bevis antyder at eksponering for miljømessige kjemikalier spiller en viktig rolle i utviklingen av T2DM. Xenobiotics-indusert ROS har blitt anerkjent som en potensiell paranoid faktor som bidrar til utviklingen av T2DM. Mennesker er utsatt for en rekke xenobiotic oval kjemikalier og det er et stort behov for romanen forskning teknikker å effektivt identifisere bukspyttkjertelen giftstoffer og undersøke mekanisme toksisitet gjelder for bukspyttkjertelen celler.
I denne studien, basert…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av et pilotprosjekt stipend fra CREH center sponset NIEHS og av National Natural Science Foundation of China (nr. 31572626).
Materials
| 10×Hank’s balanced salt solution | GIBCO | 14185-052 | |
| Collagenase Type 4 | Worthington Biochemical Corporation | CLS-4 | |
| polysucrose/sodium diatrizoate solution | Sigma | 10771 | |
| 2’,7’-dichlorofluorescein (DCFH-DA) | Sigma | D6883-50MG | |
| fluorescence microplate reader | Biotek | ||
| L-glutamine | Sigma | G8540-25G | |
| streptomycin | GIBCO | 15140148 | |
| FBS | GIBCO | 26140079 | |
| RPMI 1640 | GIBCO | 11875-085 | |
| avertin | Sigma | T48402-25G | |
| Rat/Mouse Insulin ELISA Kit | Millipore | EZRMI-13K | |
| Centrifuge | Sorval | Sorval RT7 | for 96-well plate centrifuge |
| Microplate reader | Biotek | Epoch 2 | for fluorescence reading |
Referências
- Maruthur, N. M. The growing prevalence of type 2 diabetes: increased incidence or improved survival?. Current diabetes reports. 13 (6), 786-794 (2013).
- Houstis, N., Rosen, E. D., Lander, E. S. Reactive oxygen species have a causal role in multiple forms of insulin resistance. Nature. 440 (7086), 944-948 (2006).
- Ma, Z. A., Zhao, Z., Turk, J. Mitochondrial dysfunction and beta-cell failure in type 2 diabetes mellitus. Exp Diabetes Res. , 703538 (2012).
- Valavanidis, A., Vlahogianni, T., Dassenakis, M., Scoullos, M. Molecular biomarkers of oxidative stress in aquatic organisms in relation to toxic environmental pollutants. Ecotoxicology and environmental safety. 64 (2), 178-189 (2006).
- Robertson, R. P., Harmon, J., Tran, P. O., Tanaka, Y., Takahashi, H. Glucose toxicity in β-cells: type 2 diabetes, good radicals gone bad, and the glutathione connection. Diabetes. 52 (3), 581-587 (2003).
- Kaneto, H., et al. Oxidative stress induces p21 expression in pancreatic islet cells: possible implication in beta-cell dysfunction. Diabetologia. 42 (9), 1093-1097 (1999).
- Maechler, P., Jornot, L., Wollheim, C. B. Hydrogen peroxide alters mitochondrial activation and insulin secretion in pancreatic beta cells. Journal of Biological Chemistry. 274 (39), 27905-27913 (1999).
- Gao, D., et al. The effects of palmitate on hepatic insulin resistance are mediated by NADPH Oxidase 3-derived reactive oxygen species through JNK and p38MAPK pathways. Journal of Biological Chemistry. 285 (39), 29965-29973 (2010).
- Efendić, S., et al. Pancreastatin and islet hormone release. Proceedings of the National Academy of Sciences. 84 (20), 7257-7260 (1987).
- Tian, Y., Ke, S., Denison, M. S., Rabson, A. B., Gallo, M. A. Ah receptor and NF-κB interactions, a potential mechanism for dioxin toxicity. Journal of Biological Chemistry. 274 (1), 510-515 (1999).
- Cui, H., et al. Pregnane X receptor regulates the AhR/Cyp1A1 pathway and protects liver cells from benzo-[α]-pyrene-induced DNA damage. Toxicology Letters. 275, 67-76 (2017).
- Li, L. A., Wang, P. W. PCB126 induces differential changes in androgen, cortisol, and aldosterone biosynthesis in human adrenocortical H295R cells. Toxicological Sciences. 85 (1), 530-540 (2005).
- Asahi, J., et al. Bisphenol A induces endoplasmic reticulum stress-associated apoptosis in mouse non-parenchymal hepatocytes. Life sciences. 87 (13), 431-438 (2010).
- Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. Murine pancreatic islet isolation. JoVE (Journal of Visualized Experiments). (7), e255 (2007).
- Kirstetter, P., Lagneau, F., Lucas, O., Krupa, Y., Marty, J. Role of endothelium in the modulation of isoflurane-induced vasodilatation in rat thoracic aorta. British journal of anaesthesia. 79 (1), 84-87 (1997).
- Brown, E., Umino, Y., Loi, T., Solessio, E., Barlow, R. Anesthesia can cause sustained hyperglycemia in C57/BL6J mice. Visual neuroscience. 22 (5), 615-618 (2005).
- Vaupel, D., McCoun, D., Cone, E. J. Phencyclidine analogs and precursors: rotarod and lethal dose studies in the mouse. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 230 (1), 20-27 (1984).
- Neuman, J. C., Truchan, N. A., Joseph, J. W., Kimple, M. E. A method for mouse pancreatic islet isolation and intracellular cAMP determination. Journal of visualized experiments: JoVE. (88), (2014).
