소 Cas9를 활용 하 여 복잡 한 ribonucleoprotein (RNP)은 정확 하 고 효율적인 게놈 편집에 대 한 강력한 방법입니다. 여기, 우리가 강조의 유틸리티 세포와 생물의 광범위 한 범위에 걸쳐 기본 인간 세포 등 모두 클래식 하 고 모형 유기 체를 신흥.
사이트별 진 핵 게놈 편집 CRISPR (클러스터 정기적으로 interspaced 짧은 구조 반복)-Ca (CRISPR 관련 된) 시스템 신속 하 게 다양 한 생물 학적 질문을 추구 하는 연구원 사이 평범한 되고있다. 사용자는 가장 자주 쉽게 재설정된 가이드 RNA (gRNA)와 함께 복잡 한 연쇄 상 구 균 pyogenes 에서 파생 하는 Cas9 단백질을 사용 합니다. 이러한 구성 요소는 셀에 도입 하 고 이중 가닥 DNA (dsDNA) 게놈의 상호 보완적인 영역을 페어링 자료를 통해 효소 앞 두 배 물가 틈 (DSB)를 생성 하기 위해 두 가닥. 후속 복구 무작위 삽입 또는 삭제 이벤트 (indels) 또는 휴식의 사이트에서 실험 제공 DNA의 이끌어 낸다.
순화 된 단일 가이드 RNA와 Cas9 단백질, 소는 RNP 형성 하 고 세포에 직접 전달의 사용은 매우 효율적인 유전자 편집 달성 하기 위한 강력한 접근 이다. RNP 편집 특히 유전자 삽입, 결과 달성 도전 자주 그의 속도를 향상 시킵니다. 셀 내에 Cas9 RNP의 짧은 지 속성은 플라스 미드를 통해 배달에 비해 적은 오프 대상 이벤트 리드.
자사의 장점에도 불구 하 고 CRISPR 유전자 편집의 많은 캐주얼 사용자 덜이 기술을 잘 알고 있다. 낮은 진입 장벽, 우리는 그것의 독특한 혜택 및 다양 한 응용 프로그램 컨텍스트 범위에서 RNP 전략을 구현 하기 위한 상세한 프로토콜 개요. 우리는 두 가지 유형의 기본 인간 세포, T 세포 및 조 혈 줄기/시 조 세포 (HSPCs)에서 편집 커버. 우리는 또한 어떻게 편집 하면 Cas9 RNP 최근 클래식 모델 거 위 꼬마 선 충 그리고 더 많은 포함 한 전체 유기 체의 손쉬운 유전자 조작 도입 모델 갑각류, Parhyale hawaiensis을 보여줍니다.
fThe CRISPR Cas9 시스템 과학자 들은 게놈1의 대상된 영역을 변경할 수 있습니다. 이 신속 하 고 저렴 한 기술 기초 연구에 혁명을 고2넘어 개인된 질병 치료, 정밀 농업의 발전에 지대한 영향을 만들 것을 약속 드립니다. CRISPR 편집 democratizing 도구 이며 게놈 엔지니어링, 그냥 기본적인 분자 생물학 기술 없이 특정 전문 지식이 필요로 새로운 실험실에는 시스템을 구현 합니다. 연구원은 지금 이전 다루기 힘든 생물 유전자 조작3,4에 대 한 몇 가지 대체 수단을 공부할 수 있습니다. 지난 5 년간 혼자 CRISPR 게놈 편집 사용 되었습니다 200 개 이상의 다른 척추 동물, 무척추동물, 식물, 그리고 미생물 종 하.
CRISPR 간결한 방어 통로에서 적응, 사이트별 게놈 편집에 필요한 핵심 요소 Cas9 단백질의 S. pyogenes 에서 일반적으로 및 추가 핵 지 방화 신호 (NLS), 그리고 그것의 전문화 된 코 돈 최적화 RNA 가이드5,6. 여기 설명 하지, 비록 다른 Cas9 orthologues 또는 CRISPR endonucleases 또한 사용할 수 있습니다. 자연스럽 게 발생 gRNA 두 별도로 베낀된 조각, CRISPR RNA (crRNA) 및 트랜스 활성화로 구성 된다 crRNA (tracrRNA)7. 이러한 RNAs 단일 가이드 RNA (sgRNA)8로 알려진 단일 사본으로 융합 될 수 있다. 대부분 게놈 편집자 선택 유선형된 sgRNA9, 듀얼 가이드 이기도 하지만10,11을 정기적으로 사용. 경험 20-뉴클레오티드 (nt) 게놈 DNA 대상, 그것은 protospacer 인접 한 모티브 (PAM), 라는 Cas9 인식에 필요한 짧은 라이센스 서명 옆 거짓말 보장 선택한 보완 시퀀스12 포함 하는 gRNA 디자인 .
일단 셀, 안으로 RNP 복잡 한 게놈 목표, gRNA 기초 쌍 무료 dna 물가, 및 다음 효소 앞 이중 가닥을 생성 하기 위해 두 DNA 가닥 휴식2. 두 개 이상의 경로 중 하나에 의해 DSB를 해결 하는 세포 수리 기계: 오류가 아닌-동종 끝 결합 (NHEJ) 통로 또는 상 동 감독 수리 (HDR)는 완벽 하 게 틈의 양쪽에 상 동의 ‘ 무기’를 포함 하는 DNA를 통합. 이전 복구 경로 일반적으로 이끌어 낸다 indel 형성과 필연적인 유전자 장애, 후자 허용 경험을 삽입 하거나 DNA 시퀀스1을 변경 하는 동안.
편집 효율성과 정확도는 Cas9와 gRNA는 셀에 입력 하는 방법에 따라 달라 집니다. 이러한 구성 요소는 배양된 세포, 배아, 또는 핵 산의 모양으로 또는 유기 체 소 RNP 복잡 한13,,1415로 전달 수 있습니다. 일반적인 핵 산 기반 배달 방법에는 바이러스 성 변환, transfection, 또는 electroporation mRNA 또는 플라스 미드 DNA의 포함 됩니다. Cas9 단백질 및 가이드 RNA는 세포 내에서 생산 다음 및 그들은 복합물을 형성 하.
RNP의 직접 배달 Cas9 단백질 및 가이드 RNA의 별도 정화를 요구 한다. 이 사내, 행 해질 수 있다 또는 단백질과 sgRNA 여러 상용 공급 업체 중 하나에서 구입하실 수 있습니다. 획득 되 면 Cas9와 gRNA 효소 유능한 RNP 복합물을 형성 하기 위하여 섞는 그리고 수정 된 달걀/배아, 지질에 기초를 둔 transfection16또는 electroporation에 직접 주입 하 여 셀 소개. RNP 편집의 첫 번째 보고서 관련 C. 선 충 의 생식 선17에 주입. Microinjection은 여전히 효과적인 electroporation 마우스18,19 와 쥐20 배아에서 입증 되었습니다 비록 배아와 전체 유기 체, RNP 도입의 선호 하는 수단. 우리는 직접 주입 RNP C. 선 충 의 생식 선 및 P. hawaiensis 배아에 대 한 프로토콜을 설명 하 고 특수 유형의 electroporation RNP 인간의 기본 셀을 편집할 때 제공 하는 것이 좋습니다. 이 방법은, nucleofection, 최적화 된 electroporation 프로그램 및 셀 형식 관련 솔루션을 포함 하 세포질 및 핵21입력 RNP 하며
게놈 RNP 편집 여러 가지 이점을 제공 합니다. 때문에 단백질 및 RNA 구성 요소 조립, 배달 하기 전에 품질을 보장 될 수 있는, RNP 편집 관련 핵 산 기반 배달 된 많은 함정을 피할 수 있습니다. 즉, Cas9 인코딩 DNA 주인 게놈으로 통합의 위험, mRNA는 결코 저하, 노출 그리고 vivo에서 gRNA 또는 단백질 식, 접는, 그리고 협회22,23문제 circumvents. 또한, 낮은 독성 및 플라스 미드 기반 식, 셀24,25,,2627안으로 RNP의 짧은 반감기의 결과 보다 훨씬 적은 오프 대상 이벤트 리드 RNP 사용 하 여.
마지막으로, RNP 편집 명백 하 게 이끌어 인간 세포 라인, 1 차 셀의 다양 한에서 높은 편집 속도 같은 섬유 아 세포, 배아 줄기 세포 (ESCs), 유도 만능 줄기 세포 (iSPCs), HSPCs, T 세포16,24, 25,26,27,,2829; 무척 추 동물을 포함 하 여 C. 선 충, P. hawaiensis및 과일 파리3,,1730; zebrafish, 쥐, 및 쥐31,32; 처럼 척 추가 있는 종 식물 종 등 애기, 담배, 상 추, 쌀, 포도, 애플, 옥수수, 밀33,,3435,36; 그리고 Chlamydomonas, 푸른 곰 팡이, 및에서 Candida 종37,,3839. Indel 형성의 주파수 RNP 플라스 미드 배달에 비해 사용 하 높을 수 있습니다 그리고 HDR 중재 DNA 삽입25,,2729달성 하기 쉬울 수 있다.
여기에 설명 된 프로토콜 Cas9 RNP 사용 하 고 다양 한 생물 학적 시스템40,41, 특히 일 수 없는 셀에에서 적용 하는 것은 간단를 효과적이 고, 쉽게 적응할 수 있는 기술 이다 그리고 정확한 유전자 조작에 대 한 확고 한 시스템 없이 유기 체에서. 우리는 디자인 가져오고 다른 모델 세포 유형 및 유기 체 그것의 사용을 취재 하기 전에 Cas9 RNP를 조립 하는 방법을 설명 하 여 시작 합니다. 조 혈 줄기/뿌리 (HSPCs) 세포 그리고 T 세포 그들은 함께 단계 2와 3이이 프로토콜의 덮여 있다 그래서 동일한 방법을, nucleofection를 사용 하 여 편집 됩니다. C에 대 한 절차를 편집. 선 충 4-5, 단계에 설명 되어 있습니다 및 P. hawaiensis 편집 단계 6과 7에에서 덮여 있다. 마지막으로, 모든 유기 체에서 유전자 편집 실험의 성공 유전자 시퀀싱에 의해 사정 될 수 있습니다, 모든 세포와 유기 체는 프로토콜에서 설명에 대 한 가능한 분석 방법을 설명 하는 하위 단계 8 단계에서 설명 되어 있습니다.
강력한 게놈 프로토콜 편집 설정 셀에 선 또는 관심의 유기 체 요구 최적화 하 고 경험적이 섹션에서 설명한 몇 가지 주요 매개 변수 테스트. 여기에 제시 된 일반적인 접근 방법의 몇 가지 유사 콘텐츠를 시도 하는 것은 매우 좋습니다. 이 프로토콜의 주요 한계는 다른 셀을이 메서드를 적용 하는 또는 생물 공부, 수 종에 따라 다른 결과가 발생할 수 있습니다 및 높은 효율 유전자 녹아웃 하는 실험적인 디자인 DNA 삽입을 홍보 하지 않을 수 있습니다. 따라서, 여기에 제시 된 및 아래에 설명 된 문제 해결 방법으로 시작 하는 것이 좋습니다.
게놈 편집 시 품질 문제 해결:
생성 또는 높은-품질의 시 약을 구입 어떤 게놈 프로토콜 편집에서 중요 한 단계입니다. Cas9 단백질 실험실에서 정화 하거나 상업적으로 구매 될 수 있습니다. 많은 프로토콜 RNP 조리법, Cas9에 대 한 최종 농도 참고 하지만 최적의 유전자 활동 편집 소스에 따라 달라 집니다 어떤 개별 Cas9 단백질 준비의 구체적인 활동에 따라 달라 집니다. 여기에 제시 된 프로토콜 동작 고려 RNP 넣는 Cas9 수준에 의해 최적 농도 설정 하는 데 사용의 양을 최적화: 불필요 한 대상에서 분열으로 인 없이 매우 구체적인 대상 DNA 분열을 제공 과도 한 Cas940.
가이드 RNA의 순도 균질 성공22편집 게놈의 결정을 수도 있습니다. 구입한 sgRNAs 또는 별도 crRNA 및 tracrRNA 구성 요소는 일반적으로 높은 품질의 시 약 하 고 다양 한 화학 수정 RNA 저하 문제를 방지 하거나 스며들 게 RNP91에 추가 기능을 사용할 수 있습니다. 화학적 수정 gRNAs 표준 게놈 편집 실험에 필요한 되지 않을 수 있습니다, 일부 단체는 훨씬 더 높은 효율성과 같은 시 약, 그래서 그들은 과정을 습득 후 시도할 만한 가치가 있을 수 있습니다 또는 때 편집 관찰 gRNA 저하 문제22,91나타납니다. 생체 외에서 전사 및 후속 젤 정화 실험17,21,,4950편집 일상적인 게놈에 대 한 충분 한 될 수 있는 저렴 한 대안 이다. 또한, 일반적으로 균질 성 gRNA 인구에서 vivo에서, 개별 가이드의 절단 ribozyme 및 tRNA 기반을 포함 한 생산에 적용, 연장 될 수 있습니다 체 외에서 RNA 준비 청소기를 생성 하는 몇 가지 방법을 제품92
가이드 RNA와 DNA 기증자 디자인 팁:
가이드 RNA 선택 대상에서 분열의 가능성을 최소화 하면서 매우 효율적인 대상에 편집 달성에 중요 한 요소 이다. 가이드 선택에 도움이, 몇몇 연구는 컴파일하는 데 사용 높은 처리량 화면 다음-세대 시퀀싱과 함께 성공적인 가이드47,79,,9394의 시퀀스 기능 , 9596. 이러한 기능은 예측 알고리즘 및 가이드 선택44,45,,4647,48에 도움을 온라인 도구를 개발 하기 위해 사용 되었습니다. 이러한 알고리즘은 가이드 RNA 식에 대 한 DNA 기반 시스템을 사용 하 여 화면에 기초 하 고. 가이드는 Pol III 발기인을 사용 하 여 표현 되 고 그들의 표정은 따라서 조기 종료 때 마주치의 uracil97,98, 트랙 등 유류 III 전사와 관련 된 제한 하는 경향이 99. 그러나, RNPs 사용 하 여 만든 체 외에-종합된 가이드 RNAs 그 우려를 무시 하 고 가이드 디자인에 제약을 간소화. 이 알고리즘에서 등장 하 고 매우 효과적인 게놈 편집과, 다 수의 연구에서 확인 되었다 일반적인 기능 퓨 린, 특히는 구 아닌, 가이드의 특정 대상 시퀀스의 3 ‘ 끝의 존재 이다. 이 가이드 기능 C. 선 충, 초파리, 그리고 zebrafish65,,100101포유류에서 배열 하는 생물 중 매우 성공 했다. 또한, C. 선 충에 대 한 가이드의 대상 지역의 3 ‘ 끝에 GG 디뉴클레오티드 가이드 디자인은 매우 효과적인 가이드 RNAs65예측을 위한 효과적인 전략. 이상적으로,는 특정된 응용 프로그램에 대 한 가장 성공적인 결정 하는 동시에 여러 명의 가이드를 테스트 합니다.
DNA 순서는 게놈으로 소개 하려고, 할 때 기증자 또는 템플릿 DNA의 디자인은 또한 중요 한. 단일 가닥 oligonucleotide 기증자 (ssODNs) 다른 일반적인 복구 템플릿, 선형 더블-좌초 및 플라스 미드 DNA54,,55102보다 더 안정적으로 삽입 됩니다. 일부 loci에서 비 대상에 보완 또는 DNA 물가 전치 고 상 동 팔 길이27,55에 비대칭을 ssODNs와 HDR 효율성을 개선할 수 있습니다. 복구 템플릿 컷된 사이트에 삽입 되 고 있기 때문에 대상된 시퀀스를 포함, 기증자 DNA 게놈 삽입 전후 고착에서 Cas9를 방지 하기 위해 단계를가지고 한다. 이 하 침묵 돌연변이 팸 시퀀스 또는 씨앗 지역 삽입된 유전자21,103의 기능을 유지 하면서 Cas9에 의해 인정을 피하 여 수행 됩니다. PAM에도 단일 뉴클레오티드 변화 바인딩104폐지 가능성이 있지만, 안전을 위해 적어도 4 개의 뉴클레오티드를 변경 하려고 합니다.
의미와 미래의 응용 프로그램:
CRISPR Cas9와 함께 편집 하는 게놈 어떤 유기 체의 손쉬운 유전자 조작 사용 강력한 방법으로 떠오르고 있다. 편집 Cas9 RNP와 처음에 조금 더 많은 노력을 소요 아니지만 나면 시 약 및 프로토콜은 실험실에서 사용 하는 것은 간단. 적은 대상 오프 효과24,,2526 HDR를 통해 달성 하기 어려운 유전자 삽입을 포함 하 여 더 높은 전반적인 편집 효율성 리드 플라스 미드 DNA 대신 조립된 RNP와 셀 편집 , 27 , 29. 경험와 유전자 발현, RNA 저하, 단백질 폴딩, gRNA 및 Cas9 분자 셀22,23내 별도로 합성 간의 연결 문제를 방지 하는 더. 또한 insertional mutagenesis에 대 한 안전 우려를 circumvents RNP 편집 및 바이러스 전달 방법 됩니다 때 발생할 수 있는 지속적인된 식14임상 사용. 이러한 이점 때문에 전 임상을 실시 하는 많은 과학자 개념 증명 실험 부탁 RNP 인간의 치료 응용 프로그램에 대 한 편집. 둘 다 vivo에서 및 전 비보 RNP 기반 게놈 편집 접근을 하거나 심지어 조건, 듀 켄 씨 근이 영양 증105 및 낫 세포 질병27 같은 유전 질환에서의 다양 한 개발은 에이즈29 고 암11. 흥미롭게도, Cas9 RNP는 점점 농업 공학 식물33,,3436의 편집 ‘ DNA 무료 ‘ 수 있기 때문에 대 한 전달 방법으로 사용 됩니다.
The authors have nothing to disclose.
우리는 우리의 실험실과 이러한 방법의 개발에 그들의 공헌에 대 한 베이 지역 게놈 편집 커뮤니티의 많은 이전 일원을 감사합니다. 우리는 비판적으로이 원고를 읽고에 대 한 로스 윌슨을 감사 합니다.
제이크 Aronov 선물 알렉산더 Marson의 연구를 지원 하 고 국가 다 발성 경화 증 사회 (CA 1074-A-21)을 부여 합니다. 알렉산더 Marson 버로우즈 Wellcome 기금에서 의료 과학자에 대 한 경력 수상을 보유 하 고 찬 주 커 버그 Biohub 탐정입니다. 야 곱 E. 옥수수의 연구는 재생 의학에 대 한 리 카 싱 재단, 유산 의료 의료 연구소, 그리고 캘리포니아 연구소에 의해 지원 됩니다. Behnom Farboud와 바바라 J. 마이어의 연구 부분에 NIGMS 보조금 R01 GM030702 바바라 제이 메이어, 누가 하 워드 휴즈 의학 연구소의 조사에 의해 자금입니다. 에 린 자비스와 Nipam 헤 파 텔의 연구는 일부 NSF 그랜트 IOS-1257379에 의해와 린 자비스 인정 NSF GRFP와 Philomathia 대학원 장학금 지원.
Reagents/Materials | |||
DNA oligonucleotides | Integrated DNA Technologies | – | IDT will provide custom DNA sequences, including those in Table 1 |
Guide RNAs | Synthego | – | Synthego will provide high-quality sgRNAs for S. pyogenes Cas9, including custom sgRNAs containing the targeting sequences included in Table 1 |
Purified Cas9 protein (EnGen Cas9 NLS, S. pyogenes) | New England Biosciences | M0646T | If possible, purifying Cas9 in-house or purchasing from local core facilities is a less expensive option |
Normal peripheral blood CD34+ stem/progenitor cells | AllCells | PB032-2 | |
StemSpan SFEM | StemCell Technologies | 09650 | |
StemSpan CC110 | StemCell Technologies | 02697 | |
P3 Primary Cell 4D-Nucleofector X Kit | Lonza | V4XP-3032 | |
RPMI-1640 Medium, With sodium bicarbonate, without L-glutamine, liquid | Sigma | R0883-6X500ML | |
EasySep™ Human T Cell Isolation Kit | Stemcell | 17951 | |
cell culture plate, 96 wells, round | Fisher Scientific | 3799 | |
CTS (Cell Therapy Systems) Dynabeads CD3/CD28 | Life Tech | 40203D | |
Reombinant Human IL-2 | UCSF Pharmacy | NA | |
SepMate-50 500-pack IVD | Stemcell Technologies | 85460 | |
OP50 Escherichia coli | Caenorhabditis Genetics Center | OP-50 | https://cgc.umn.edu/ |
Nematode Growth Media agar in petri dishes | – | – | See Stiernagle, T (ref. 59) |
Standard borosilicate glass capillaries with filament: 4 in (100 mm), 1/0.58 OD/ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | |
Single-barrel standard borosilicate glass capillaries: 6 in (152 mm), 2/1.12 OD/ID | World Precision Instruments | 1B200-6 | |
Cover glass; 24 × 50 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-544E | |
Cover glass; 22 × 22 mm | Thermo Fisher Scientific | 12-518-105K | |
Apex LE agarose | Genesee Scientific | 20-102 | |
Halocarbon oil 700 | Sigma-Aldrich | H8898-100ML | |
pCFJ90 plasmid | Addgene | 19327 | |
Compressed nitrogen | – | ||
60 mM culture dishes | BD | ||
Capillary tubes with filament: 4 in (1.0 mm) | World Precision Instruments | T2100F-4 | |
Sylgard 184 | Dow Corning | ||
Petri dishes (100 × 15 mm) | – | ||
Tungsten wire (0.005 in. diameter) | Ted Pella | ||
Perfluoroalkoxy alkane (PFA) | – | ||
Marine salt | – | ||
9" pasteur pipettes | – | ||
Phenol red | – | ||
Nuclease-free water | – | ||
Equipment | |||
4D Nucleofector | Lonza | AAF-1002X | |
MZ75 Stereomicroscope | Leica | Out-of-production. Current model is the M80 Stereomicroscope | |
Axio Vert35 inverted phase contrast fluorescent microscope | Zeiss | Out-of-production. Current model is the Axio VertA.1 | |
Laser-based micropipette puller (for C. elegans protocol) | Sutter Instrument | FG-P2000 | |
Picoliter Microinjector (for C. elegans protocol) | Warner Instruments | PLI-100A | |
Three-axis Joystick oil hydraulic micromanipulator | Narishige International | MO-202U | |
Coarse manipulator | Narishige International | MMN-1 | |
Micropipette puller (for P. hawaiensis protocol) | Sutter Instrument | P-80/PC | |
Microinjector (for P. hawaiensis protocol) | Narishige | IM300 | |
Microloader pipette tips | Eppendorf | 5242956003 | |
NG-agar |