JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

بناء المستحثة "الببتيدات حلزونية عبر صور" ثيول-شرق/ين هيدروثيوليشن ثيوثير/"كبريتيد ثنائي الفينيل"-المربوطة

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

نقدم على بروتوكول لبناء ثيويثير/الفينيل الببتيدات حلزونية المربوطة كبريتيد استخدام المستحثة بصور هيدروثيولاتيون ثيول-شرق/ثيول-ين.

Abstract

هنا، يمكننا وصف بروتوكول مفصلة لإعداد الببتيدات المربوطة ثيويثير باستخدام هيدروثيولاتيون على راتنج إينتراموليكولار/الجزيئات ثيول-شرق. وبالإضافة إلى ذلك، يصف هذا البروتوكول إعداد الببتيدات الفينيل-كبريتيد المربوطة باستخدام هيدروثيولاتيون في حل إينتراموليكولار ثيول-ين بين amino acids التي تمتلك سلاسل الجانب الكين/ألكاين وبقايا السيستين في الأول، وأنا + 4 وظائف. تم توليفها الببتيدات الخطي باستخدام توليفة ببتيد المرحلة الصلبة قياسية المستندة إلى معتدلاً (الكائنة). ويضطلع ثيول-شرق هيدروثيولاتيون استخدام فعل شرق الايثير إينتراموليكولار أو فعل شرق الايثير الجزيئات، اعتماداً على طول الببتيد. في هذا البحث، يتم فعل شرق الايثير إينتراموليكولار في حالة الببتيدات أقصر باستخدام deprotection على راتنج المجموعات ترتيل سيستين المخلفات بعد إكمال تركيب الببتيد الخطي. ثم يتم تعيين الراتنج لإشعاع الأشعة فوق البنفسجية باستخدام فوتوينيتياتور 4-ميثوكسياسيتوفينوني (خريطة) و 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). يجري تفاعل الجزيئات ثيول-شرق بتذويب معتدلاً-Cys-OH في مذيب-dimethylformamide (DMF) ن، ن. هذا هو رد فعل ثم مع الببتيد باستخدام بقايا الكين الحاملة على راتنج. بعد ذلك، ماكرولاكتاميزيشن يجري استخدام سداسي فلوروفوسفات بينزوتريازولي-1-يل-أوكسيتريبيروليدينوفوسفونيوم (بيبوب) و 1-هيدروكسيبينزوتريازولي (هوبت) 4-ميثيلمورفوليني (نم) الكواشف التنشيط في الراتنج. بعد ماكرولاكتاميزيشن، هو استمرار التوليف الببتيد استخدام الكائنة القياسية. في حالة هيدروثيوليشن ين الايثير، المشقوق من الراتنج الببتيد الخطي، والمجففة، وحلت في وقت لاحق في يطرد DMF. وهذا هو المشع ثم استخدام ضوء الأشعة فوق البنفسجية مع فوتوينيتياتور 2، 2-ديميثوكسي-2-فينيلاسيتوفينوني (DMPA). وفي أعقاب رد الفعل، يتبخر DMF وبقايا النفط الخام هو عجل وتنقيته باستخدام كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء ([هبلك]). يمكن أن تعمل هذه الأساليب تبسيط جيل الببتيدات دوري المربوطة ثيوثير بسبب استخدام الكيمياء انقر الايثير-شرق/ين أنه يمتلك مجموعة وظيفية متفوقة التسامح ومحصول جيد. إدخال سندات ثيوثير في الببتيدات يستفيد من طبيعة تفاعلات من بقايا السيستين وهو الأكسدة خاملة بالنسبة للسندات ثنائي كبريتيد.

Introduction

تطوير يغاندس تعدل تفاعلات البروتين البروتين (القياسية) يوفر نهج جذابة لاكتشاف الأدوية الحديثة. وهكذا، قد استثمر قدرا كبيرا من الجهد في دراسة الطرائق الكيميائية الرواية التي يمكن أن تعدل كفاءة القياسية1،،من23. القياسية تتألف عموما من السطوح المتفاعلة ضحلة كبيرة و/أو توقف، والجزيئات الصغيرة تعتبر عادة أن يغاندس غير مناسب لتحوير القياسية4،5. مع منطقة مكشوفة متفاعلة سطحية مناسبة، تمثل الببتيدات القصيرة التي تحاكي السمات الهيكلية لواجهات البروتين المرشحين المثالي لمعالجة هذه المشكلة6،7. بيد أن الببتيدات قصيرة عادة غير منظم في محلول مائي. وهذا يرجع إلى أن جزيئات الماء التي تتنافس مع شبكة الربط إينتراموليكولار الهيدروجين الببتيد العمود الفقري والمعالم والتشكلات غير مواتية انتروبيكالي في الماء8. وباﻹضافة إلى ذلك، الببتيدات المنخفضة أصلاً الاستقرار وخصائص نفاذية الخلية إلى حد كبير الحد من استخدامها في التطبيقات البيولوجية9،10. ووفقا لتحليل البيانات المصرفية (PDB) البروتين، > 50% القياسية تشمل قصيرة α-الحلزون التفاعلات11. وهكذا، تم وضع الطرق الكيميائية المختلفة فيما يتعلق باستقرار اللولب. هذه تشمل ثنائي كبريتيد/ثيوثير بوند تشكيل12،،من1314، إغلاق الطوق الناتج15، وتشكيل عصابة لاكتام16، “انقر فوق” الكيمياء17، إضافة بيرفلوروارينيس18،19، وكبريتيد ثنائي الفينيل تشكيل20.

استقرت الببتيدات حلزونية وتستخدم على نطاق واسع لمختلف الأهداف داخل الخلايا، بما في ذلك p53، الإستروجين مستقبلات، رأس، BCL-2 الأسرة البروتينات، والبعض الآخر21،22،،من2324. الرن-6924، جميع هيدروكربونية تدبيس الببتيد المانع المزدوج MDM2 ومدمكس، ويستخدم حاليا للتحقيق السريرية25. في السنوات القليلة الماضية، ركزت مجموعتنا على تطوير أساليب تحقيق الاستقرار الببتيد رواية استخدام ثيول-شرق وين ثيول ردود الفعل26،،من2728. وبصفة عامة، لقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه الصورة بدأت كفاءة تحت ظروف معتدلة عندما يستخدم بطبيعة الحال سيستين وفيرة. وباﻹضافة إلى ذلك، وقد أظهرنا أن ردود الفعل هذه قد التسامح مجموعة وظيفية ممتازة، متعامد الحيوية، وقد ثبت أن تكون قابلة للتطبيق ل التعديلات الببتيد والبروتين29. ثيوثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات الناتجة إلى حد كبير تحسين الفضاء الكيميائية من الببتيدات القيد وتوفير مركز مجا على حبل تعديل، وثبت لتكون قابلة للتطبيق للاستخدام في التطبيقات البيولوجية العديدة30 ،،من3132. حتى الآن، وقد وصف التقارير محدودة فقط بخصوص سيكليزيشن الببتيد ثيول-شرق/ثيول-ين. في دراسة نشرتها أنسيته et al. في عام 2009، كان رد فعل على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق الببتيد سيكليزاتيون بين الالكينات المنشط مع سيستين أظهرت33. في عام 2015، تشو وآخرون. ووصف رد فعل اثنين-عنصر جذري بدأ ثيول-شرق الببتيد التدبيس34 و رد اقتران ثيول-ين/شرق اللاحقة، متسلسلة35. في الآونة الأخيرة، وصفت لنا سلسلة من العمل القائم على ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة الببتيدات20،،من2627. ويصف هذا البروتوكول توليفة مفصلة من الببتيدات المذكورة أعلاه ثيويثير/الفينيل كبريتيد المربوطة بالأمل في أنه سيكون من المفيد للمجتمع البحث الأوسع نطاقا.

Protocol

1-معدات التحضير للجهاز اليدوي الببتيد-التوليف، مكان مشعب فراغ (جدول المواد) في غطاء دخان تتسم بكفاءة. بعد ذلك، ضع ستوبكوكس الثلاثية على فراغ المتشعبة وقم بتوصيلها بخط غاز النيتروجين أو الأرجون. كاب جميع المداخل غير المستخدمة باستخدام المطاط سيتا. قم بتوصيل أعمدة مملوءة…

Representative Results

[هبلك] ومرض التصلب العصبي المتعدد الأطياف الببتيد التيار المتردد-يمس5آآك–NH2 ومنتجاتها ﺣﻭﻟﻳ Ac-Y-(سيكلو-1.5)-[mS5AAAC]–NH2 التي تم إنشاؤها باستخدام فوتوريكشن على راتنج إينتراموليكولار ثيول-شرق يصور في الشكل 6B-تبين أن وزن الجزيئي متطابقة ب?…

Discussion

في سيكليزاتيون على راتنج إينتراموليكولار الايثير-شرق المبينة في الشكل 3، تم العثور على إزالة مجموعة تريتيل من بقايا السيستين أن تكون خطوة حاسمة بالنسبة فوتوريكتيون اللاحقة. وباﻹضافة إلى ذلك، الوزن الجزيئي الببتيد قبل وبعد تم العثور على رد فعل تكون متطابقة كما صورت في <stron…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

الكتاب الاعتراف بدعم مالي من “مؤسسة العلوم الطبيعية لمنح الصين” (رقم 21372023، 21778009 و 81701818)؛ وزارة العلوم والتكنولوجيا في الجمهورية الشعبية للصين (رقم 2015DFA31590)؛ شنتشن لجنة العلم والتكنولوجيا الابتكار (رقم JCYJ20170412150719814، JCYJ20170412150609690، JCYJ20150403101146313، JCYJ20160301111338144، JCYJ20160331115853521، JSGG20160301095829250، و GJHS20170310093122365)؛ ومؤسسة الصين لعلوم ما بعد الدكتوراه (رقم 2017 م 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/pt/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image