JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Química

Konstruere Thioether/Vinyl sulfid-tøjret spiralformet peptider Via foto-induceret Thiol-fje/yne Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Vi præsenterer en protokol til opførelse af thioether/vinyl sulfid-tøjret spiralformet peptider ved hjælp af foto-induceret thiol-fje/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Her beskriver vi en detaljeret protokol for forberedelse af thioether-bundet peptider ved hjælp af på harpiks intramolekylære/intermolekylære thiol-en hydrothiolation. Derudover beskriver denne protokol forberedelse af vinyl-sulfid-tøjret peptider ved hjælp af i-løsning intramolekylære thiol-yne hydrothiolation mellem amino acids, der besidder Alken/alkyn sidekæder og cystein restkoncentrationer ved jeg, jeg + 4 positioner. Lineær peptider blev syntetiseret ved hjælp af en standard Fmoc-baserede faststadie syntese (SPP’ER). Thiol-en hydrothiolation udføres ved hjælp af enten en intramolekylære thio-en reaktion eller en intermolekylære thio-en reaktion, afhængigt af peptid længde. I denne forskning udføres en intramolekylære thio-en reaktion i tilfælde af kortere peptider ved hjælp af på harpiks deprotection af trityl grupperne af cystein rester efter komplet syntesen af den lineære peptid. Harpiks er derefter sat til UV-bestråling ved hjælp af photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kort) og 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). De intermolekylære thiol-fje reaktionen udføres ved at opløse Fmoc-Cys-OH i et N, N– dimethylformamid (DMF) opløsningsmiddel. Dette er derefter reagerede med peptid ved hjælp af Alken-bærende rester på harpiks. Ovenpå udføres macrolactamization ved hjælp af benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) og 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivering reagenser på harpiks. Efter macrolactamization, faststadie peptidsyntese er fortsat ved hjælp af standard SPP’ER. I forbindelse med thio-yne hydrothiolation, er den lineære peptid kløvet fra harpiks, tørret og derefter opløst i afgassede DMF. Dette er derefter bestrålet med UV-lys med photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Efter reaktionen, DMF er fordampet og den rå rest er fældet og renset ved hjælp af high-performance væskekromatografi (HPLC). Disse metoder kan fungere for at forenkle generation af thioether-bundet cyklisk peptider fra anvendelse af thio-fje/yne Klik kemien, der besidder overlegne funktionsgruppe tolerance og godt udbytte. Indførelsen af thioether obligationer i peptider udnytter naturens nukleofil af cystein restkoncentrationer og er redox-inaktivt i forhold til disulfid obligationer.

Introduction

Udviklingen af ligander til at modulere protein-protein interaktioner (ppi) giver en attraktiv tilgang til moderne drug discovery. Således, en stor indsats er blevet investeret i at studere roman kemiske metoder, der effektivt kan modulere PPI1,2,3. Producentprisindeks består som regel af lavvandede, store og/eller udgåede interagerende overflader, og små molekyler er typisk anset for at være uegnet ligander til graduering af PPI4,5. Med en egnet udsatte interagerende overflade område repræsenterer kort peptider, der efterligner de strukturelle egenskaber af protein grænseflader ideelle kandidater til at løse dette problem6,7. Korte peptider er dog typisk ustruktureret i en vandig opløsning. Dette er at vandmolekyler, der konkurrerer med intramolekylære brint limning netværk af peptid rygraden og veldefinerede konformationer er entropically ugunstige i vand8. Derudover peptider i sagens natur lav stabilitet og permeabilitet celleegenskaber i høj grad begrænse deres brug i biologisk programmer9,10. Ifølge protein data bank (FBF) analyse, > 50% af PPI omfatter korte α-helix interaktioner11. Således er forskellige kemiske metoder blevet udviklet med hensyn til helix stabilisering. Disse omfatter disulfid/thioether bond dannelse12,13,14, ring-lukning metathesis15, lactam ring dannelse16, “Klik” kemi17, tilsætning af perfluoroarenes18,19, og vinyl-sulfid dannelse20.

Stabiliseret spiralformet peptider udnyttes bredt for forskellige intracellulære mål, herunder p53, østrogen receptorer, Ras, BCL-2 familie proteiner, og andre21,22,23,24. ALRN-6924, en all-kulbrinte hæftet peptid dual hæmmer af MDM2 og MDMX, der aktuelt anvendes for kliniske undersøgelse25. I de sidste par år, har vores gruppe fokuseret på udviklingen af roman peptid stabilisering metoder ved hjælp af thiol-fje og thiol-yne reaktioner26,27,28. I almindelighed, viste vi, at disse foto-initierede reaktioner er effektiv milde betingelser, når naturligvis rigelige cystein er brugt. Derudover har vi vist at disse reaktioner har en fremragende funktionsgruppe tolerance, er bio-ortogonale, og har vist sig for at være gældende for peptid og protein ændringer29. De resulterende thioether/vinyl sulfid tøjret peptider i høj grad forbedre den kemiske plads af constraint peptider, give en labile på tether ændring center og er bevist for at være gældende for anvendelser i mange biologiske ansøgninger30 ,31,32. Til dato, er blevet beskrevet kun begrænset rapporter vedrørende thiol-fje/thiol-yne peptid cyclization. I en undersøgelse offentliggjort af Anseth et al. i 2009, var en på harpiks intramolekylære thiol-en reaktion for peptid cyclization mellem aktiveret alkener med cystein demonstreret33. I 2015, Chou mfl. beskrevet en to-komponent radikal indviede thiol-en reaktion for peptid hæftning34 og en efterfølgende, sekventiel thiol-yne/en kobling reaktion35. Vi beskrev for nylig, en serie af arbejde baseret på thioether/vinyl sulfid tøjret peptider20,26,27. Denne protokol beskriver en detaljeret syntese af ovennævnte thioether/vinyl sulfid tøjret peptider i håb om at det vil være nyttigt for det bredere forskersamfundet.

Protocol

1. udstyr forberedelse Apparatet manuelle peptid-syntese placere et vakuum manifold (Table of Materials) i et effektivt stinkskab. Dernæst sted trevejsspærreventiler på vakuum manifold og forbinde dem til en nitrogen eller argon gas linje. Cap alle ubrugte fjorde bruger gummi septa. Tilslut harpiks-fyldte kolonner (0,8 x 4 cm, 10 mL reservoir, se Tabel af materialer) til manifold bruger trevejsspærreventiler (figur 1). Bruge en pumpe,…

Representative Results

HPLC og MS-spektre af peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 og sin genindvundet produkt Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 der blev genereret ved hjælp af på harpiks intramolekylære thiol-en photoreaction er afbildet i figur 6b. den cykliske peptid fandtes for at have en identisk Molekylær vægt i forhold til dens lineære forløber. Imidlertid blev sin HPLC retentionstid observeret for at være ca. 2 min. tidligere end i sin …

Discussion

I på harpiks intramolekylære thio-en cyclization beskrevet i figur 3, blev fjernelse af trityl gruppen af cystein rester fundet for at være et afgørende skridt for den efterfølgende photoreaction. Derudover afbildet peptid molekylvægt forud for og efter reaktionen blev anset for at være den samme som i fig. 6B. Derfor, anvendelse af en HPLC identifikation eller en DTNB analyse er påkrævet for at overvåge reaktionen. I tilfælde af intermolekylære thio…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Forfatterne anerkender økonomisk støtte fra Natural Science Foundation i Kina tilskud (nr. 21372023, 21778009 og 81701818); Ministeriet for videnskab og teknologi i Folkerepublikken Kina (No. 2015DFA31590); Shenzhen videnskab og teknologi Innovation Udvalget (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 og GJHS20170310093122365); og Kina postdoc Science Foundation (No. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/pt/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image