JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Bouw van de Thioether/Vinyl Sulfide-aangebonden Helical peptiden Via foto-geïnduceerde Thiol-Ono/yne Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

We presenteren een protocol voor de bouw van thioether/vinyl sulfide-aangebonden spiraalvormige peptiden met behulp van foto-geïnduceerde thiol-Ono/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol voor de bereiding van thioether-aangebonden peptiden op-hars intramoleculaire/intermoleculaire thiol-een hydrothiolation gebruiken. Bovendien, beschrijft dit protocol de bereiding van vinyl-sulfide-aangebonden peptiden met behulp van in-oplossing intramoleculaire thiol-yne hydrothiolation tussen amino acids die alkeen/alkyn zijketens bezitten en cysteïne residuen op de i, i + 4 posities. Lineaire peptiden werden gesynthetiseerd met behulp van een standaard Fmoc gebaseerde solid-phase peptide synthese (SPPS). Thiol-een hydrothiolation wordt uitgevoerd met behulp van een intramoleculaire thio-een reactie of een reactie van de intermoleculaire thio-Ono, afhankelijk van de lengte van de peptide. In dit onderzoek, is een intramoleculaire thio-een reactie in het geval van Kortere peptides met behulp van op-hars deprotection van de trityl-groepen van cysteïne residuen na de volledige synthese van de lineaire peptide uitgevoerd. De hars wordt vervolgens ingesteld op UV-bestraling met behulp van photoinitiator 4-methoxyacetophenone (kaart) en 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). De intermoleculaire thiol-een reactie wordt uitgevoerd door het oplossen van Fmoc-Cys-OH in een N, N– dimethylformamide (DMF) oplosmiddel. Dit is vervolgens reageerde met de peptide met behulp van het alkeen-bevattende residu op hars. Na dat, wordt de macrolactamization uitgevoerd met behulp van benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorfosfaat (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) en 4-Methylmorfoline (NMM) als activering reagentia op de hars. Na de macrolactamization, de peptide synthese wordt voortgezet met behulp van standaard SPPS. In het geval van de thio-yne hydrothiolation, is de lineaire peptide gekloofd uit de hars, gedroogd en vervolgens opgelost in ontgaste DMF. Dit wordt vervolgens bestraald met behulp van UV-licht met photoinitiator 2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone (DMPA). Naar aanleiding van de reactie, DMF is verdampt en het ruw residu wordt neergeslagen en gezuiverd met behulp van krachtige vloeibare chromatografie (HPLC). Deze methoden kunnen functioneren ter vereenvoudiging van de generatie van thioether-aangebonden cyclische peptiden als gevolg van het gebruik van de thio-Ono/yne Klik chemie die beschikt over superieure functiegroep tolerantie en goede opbrengst. De introductie van thioether bindingen in peptiden haalt voordeel uit de nucleofiele aard van cysteïne residuen en redox-inert ten opzichte van disulfide bindingen.

Introduction

De ontwikkeling van liganden te moduleren van eiwit-eiwitinteractie (PPIs) biedt een aantrekkelijke aanpak voor moderne drugontdekking. Dus, heeft een grote hoeveelheid inspanning is geïnvesteerd in studeren roman chemische modaliteiten die efficiënt PPIs1,2,3 moduleren kunnen. PPIs in het algemeen bestaat uit ondiep, grote, en/of beëindigde interagerende oppervlakken, en kleine moleculen worden meestal beschouwd als ongeschikt liganden voor de modulatie van PPIs4,5. Met een geschikte blootgestelde interagerende oppervlakte vertegenwoordigen korte peptiden die het nabootsen van de structurele kenmerken van eiwit interfaces ideale kandidaten aan te pakken dit probleem6,7. Korte peptides zijn echter meestal ongestructureerde in een waterige oplossing. Dit is de wijten aan het feit dat de watermoleculen die met de intramoleculaire waterstof binding netwerk van de peptide ruggengraat en welomschreven conformaties concurreren zijn entropically ongunstige in water8. Bovendien, de peptiden inherent lage stabiliteit en eigenschappen van de permeabiliteit van de cel grotendeels hun gebruik in biologische toepassingen9,10te beperken. Volgens de protein data bank (PDB) analyse, > 50% van alle PPIs betrokken korte α-helix interacties11. Zo zijn verschillende chemische methoden ontwikkeld met betrekking tot de stabilisatie van de helix. Deze omvatten bisulfide/thioether bond vorming12,13,14, ring-sluiting Metathese15, lactam ring vorming16, “Klik” chemie17, toevoeging van perfluoroarenes18,19, en vinyl-sulfide vorming20.

Gestabiliseerde spiraalvormige peptiden zijn wijd gebruikt voor verschillende intracellulaire streefcijfers, met inbegrip van p53, oestrogeen receptoren, Ras, BCL-2 familie eiwitten, e.a.21,22,23,24. ALRN-6924, een all-koolwaterstof geniet van peptide dual remmer van MDM2 en MDMX, wordt momenteel gebruikt voor klinisch onderzoek25. Onze fractie heeft in de afgelopen paar jaar gericht op de ontwikkeling van nieuwe peptide stabilisatie methoden met thiol-Ono en thiol-yne reacties26,27,28. In het algemeen, hebben we aangetoond dat deze reacties foto aangestuurde efficiënte milde omstandigheden wanneer natuurlijk overvloedige cysteïne wordt gebruikt. Bovendien hebben we aangetoond dat deze reacties een uitstekende functionele groep tolerantie hebben, bio-orthogonaal zijn, en zijn bewezen om te worden toegepast voor peptide en proteïne wijzigingen29. De resulterende thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden grotendeels verbeteren de chemische ruimte van beperking peptides, bieden een labiele op-ketting wijziging center en is bewezen dat de gelden voor gebruik in talrijke biologische toepassingen30 ,31,–32. Tot op heden zijn slechts beperkt rapporten beschreven met betrekking tot thiol-Ono/thiol-yne peptide cyclisatie. In een studie gepubliceerd door Anseth et al. in 2009, was een reactie op-hars intramoleculaire thiol-Ono voor peptide cyclisatie tussen geactiveerde alkenen met cysteïne aangetoonde33. In 2015, Chou et al. een tweecomponenten radicale ingewijden thiol-een reactie voor peptide nieten34 en een latere, sequentiële thiol-yne/een koppeling reactie35beschreven. Onlangs, beschreven we een aantal werkzaamheden op basis van thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden20,26,27. Dit protocol beschrijft een gedetailleerde synthese van de bovengenoemde thioether/vinyl sulfide aangebonden peptiden in de hoop dat het zal nuttig zijn voor de ruimere onderzoeksgemeenschap.

Protocol

1. apparatuur voorbereiding Voor de handmatige peptide-synthese-apparaat, plaatst u een vacuüm variëteit (Tabel van materialen) in een efficiënte zuurkast. Vervolgens plaats drieweg kranen op het vacuüm spruitstuk en hen verbinden met een stikstof of argon gas lijn. Cap alle ongebruikte inhammen met rubber septa. Hars gevulde kolommen (0.8 x 4 cm, 10 mL reservoir, Zie Tabel van materialen) verbinden met de variëteit met behulp van de drie-weg kranen (<strong clas…

Representative Results

De HPCL-samenstelling en MS-spectra van de peptide Ac-YmS5AAAC-NH2 en haar cyclized product Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 die zijn gegenereerd met behulp van de op-hars intramoleculaire thiol-een reactiemechanisme zijn afgebeeld in figuur 6b. het cyclisch peptide bleek te hebben een identieke molecuulgewicht ten opzichte van zijn voorloper van lineaire. De HPLC-retentietijd werd echter waargenomen worden ongev…

Discussion

In de op-hars intramoleculaire thio-Ono cyclisatie beschreven in Figuur 3, is de verwijdering van de trityl groep van een cysteine residu bleek te zijn een belangrijke stap voor de latere reactiemechanisme. Bovendien, het molecuulgewicht van de peptide voorafgaand aan en na die de reactie bleek te zijn identiek als afgebeeld in figuur 6B. Dus, het gebruik van een HPLC-identificatie of een DTNB-test is vereist om te controleren de reactie. In het geval van de int…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

De auteurs erkennen financiële steun van de Natural Science Foundation van China subsidies (nr. 21372023, 21778009 en 81701818); het ministerie van wetenschap en technologie van de People’s Republic van China (nr. 2015DFA31590); het Shenzhen wetenschap en de technologie innovatie Comité (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 en GJHS20170310093122365); en de China postdoctorale Science Foundation (nr. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/pt/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image