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Química

Bau von Thioether/Vinyl-sulfid-angebunden spiralförmige Peptide über Foto-induzierte Thiol-ene/Yne Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll für den Bau von Thioether/Vinyl sulfid angebunden spiralförmige Peptide mit Foto-induzierte Thiol-ene/Thiol-Yne Hydrothiolation.

Abstract

Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Vorbereitung der Thioether angebunden Peptide mit am Harz Intramolekulare/intermolekulare Thiol-ene Hydrothiolation. Dieses Protokoll beschreibt darüber hinaus die Vorbereitung der Vinyl-sulfid-angebunden Peptide mit in Lösung Intramolekulare Thiol-Yne Hydrothiolation zwischen Amino acids, die Alken/Alkinen Seitenketten besitzen und Cystein Rückstände am ich, ich + 4 Positionen. Mit einem standard Fmoc-basierte Festphasen-Peptidsynthese (SPPS) lineare Peptide synthetisiert. Thiol-ene Hydrothiolation erfolgt über eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion oder eine intermolekulare Thio-ene Reaktion abhängig von der Peptid-Länge. In dieser Studie erfolgt eine Intramolekulare Thio-ene Reaktion bei kürzeren Peptiden mit auf Harz-Deprotection der Trityl Gruppen von Cystein-Rückstände, die nach der vollständigen Synthese von linearen Peptid. Das Harz wird dann auf UV-Bestrahlung mit Photoinitiator 4-Methoxyacetophenone (MAP) und 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP) festgelegt. Die intermolekularen Thiol-ene Reaktion erfolgt durch Fmoc-Cys-OH in einem N, N– Dimethylformamid (DMF) Lösungsmittel auflösen. Dies wird dann mit dem Peptid mit der Alken-Lager Rückstand auf Harz reagiert. Danach die Macrolactamization erfolgt mit benzotriazol-1-Yl-Oxytripyrrolidinophosphonium Hexafluorophosphate (PyBop), 1-Hydroxybenzotriazole (HoBt) und 4-Methylmorpholine (NMM) als Aktivierung Reagenzien auf das Harz. Im Anschluss an die Macrolactamization die Peptidsynthese wird fortgesetzt mit standard SPPS. Im Falle der Thio-Yne Hydrothiolation der linearen Peptid gespalten aus dem Harz, getrocknet und anschließend in entgastem DMF gelöst. Dies wird dann bestrahlt, mit UV-Licht mit Photoinitiator 2,2-Dimethoxy-2-Phenylacetophenone (DMPA). Nach der Reaktion DMF wird verdampft und die grobe Rückstände wird ausgefällt und gereinigt mit Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC). Diese Methoden könnte funktionieren, um die Generation der Thioether angebunden zyklische Peptide durch den Einsatz von Thio-ene/Yne Click-Chemie zu vereinfachen, die überlegene funktionelle Gruppe Toleranz und guten Ertrag besitzt. Die Einführung von Thioether Anleihen in Peptide nutzt der nukleophilen Natur von Cystein-Rückständen und Redox-inert gegenüber Disulfid-Bindungen.

Introduction

Die Entwicklung des Liganden zu modulieren, Protein-Protein-Wechselwirkungen (PPI) bietet ein attraktives Konzept für die moderne Arzneimittelforschung. So wurde viel Aufwand in Studium neuartige chemische Modalitäten investiert, die effizient ppi1,2,3modulieren kann. Ppi in der Regel bestehen aus flachen, großen und/oder aufgegebenen wechselwirkenden Oberflächen und kleine Moleküle sind in der Regel als ungeeignet Liganden für die Modulation des ppi4,5. Mit einer geeigneten exponierten interagierende Fläche stellen kurze Peptide, die die strukturellen Merkmale des Proteins Schnittstellen imitieren ideale Kandidaten für dieses Problem6,7Adresse dar. Kurze Peptide sind jedoch in der Regel unstrukturiert in einer wässrigen Lösung. Dies ist die Wassermoleküle, die mit dem Intramolekulare Wasserstoff Verklebung Netzwerk der Peptidrückgrat und klar definierte Konformationen konkurrieren im Wasser8entropically ungünstig sind. Darüber hinaus die Peptide von Natur aus geringe Stabilität und Durchlässigkeit Zelleneigenschaften weitgehend beschränken ihre Verwendung in Anwendungen in der Biologie9,10. Nach der Protein Data Bank (PDB) Analyse > 50 % der PPI beinhalten kurze α-Helix-Wechselwirkungen-11. So wurden verschiedene chemische Methoden in Bezug auf Helix Stabilisierung entwickelt. Dazu gehören Disulfid/Thioether Anleihe Bildung12,13,14, Ring-Schließung Metathese15, Lactam-Ring Bildung16, “klicken” Chemie17, Zugabe von Perfluoroarenes18,19und Vinyl-sulfid Bildung20.

Stabilisierte spiralförmige Peptide werden weithin genutzt, für verschiedene intrazelluläre Ziele, einschließlich p53, Östrogen-Rezeptoren, Ras, BCL-2 Familie Proteine und andere21,22,23,24. ALRN-6924, eine All-Kohlenwasserstoff Peptid duale Inhibitor von MDM2 und MDMX geheftet, ist derzeit für klinische Untersuchung25verwendet wird. In den letzten Jahren konzentriert sich unsere Gruppe auf die Entwicklung von neuartigen Peptid-Stabilisierung-Methoden mit Thiol-ene und Thiol-Yne Reaktionen26,27,28. Im Allgemeinen haben wir gezeigt, dass diese Foto-initiierten Reaktionen sind effizient unter milden Bedingungen, wenn natürlich reichlich Cystein verwendet wird. Darüber hinaus haben wir gezeigt, dass diese Reaktionen eine ausgezeichnete funktionelle Gruppe Toleranz haben, sind Bio-orthogonal und erwiesen sich als für Peptid und Protein Änderungen29anwendbar. Die daraus resultierende Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide weitgehend verbessern den chemischen Raum Einschränkung Peptide, bieten eine labile-Tether Modification Centers und erweist sich für den Einsatz in zahlreichen Anwendungen in der Biologie30 ,31,32. Bisher wurden nur begrenzte Berichte über Thiol-ene/Thiol-Yne Peptid biosyntheseschritt beschrieben. In einer Studie von Anseth Et Al. im Jahr 2009 war eine Reaktion auf Harz Intramolekulare Thiol-ene für Peptid-biosyntheseschritt zwischen aktivierten Alkenen mit Cystein demonstriert33. Im Jahr 2015 Chou Et Al. eine Zweikomponenten-radikale initiiert Thiol-ene Reaktion für Peptid Heften34 und eine anschließende, sequentielle Thiol-Yne/ene Kupplung Reaktion35beschrieben. Vor kurzem haben wir eine Reihe von arbeiten, die basierend auf Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide20,26,27beschrieben. Dieses Protokoll beschreibt eine detaillierte Synthese der oben genannten Thioether/Vinyl sulfid angebunden Peptide in der Hoffnung, dass es für die Allgemeinheit Forschung nützlich sind.

Protocol

1. Ausrüstung Vorbereitung Legen Sie für die manuelle Peptid-Synthese-Apparat einen Vakuum-Verteiler (Table of Materials) in einen effizienten Abzug. Als nächstes legen Sie drei-Wege-Hähne auf Vakuum Krümmer und verbinden Sie diese mit Stickstoff oder Argon Gas-Linie. Verschließen Sie alle unbenutzten Eingänge mit Kautschuk Septen. Schließen Sie Harz gefüllten Spalten (0,8 x 4 cm, 10-mL-Behälter, siehe Tabelle der Materialien) an die monteurhilfe mit der dre…

Representative Results

Die HPLC und MS Spektren von Peptid Ac-YmS5AAAC-NH2 und deren cyclisiert Produkt Ac – Y-(Cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 , die erstellt wurden mit der am Harz Intramolekulare Thiol-ene Photoreaktion in Abbildung dargestellt 6 b. das zyklische Peptid wurde festgestellt, dass eine identische Molekulargewicht im Verhältnis zu seinem linearen Vorläufer haben. Die HPLC-Verweilzeit wurde allerdings beobachtet, ca. 2 min frü…

Discussion

In der am Harz Intramolekulare Thio-ene biosyntheseschritt in Abbildung 3beschrieben die Beseitigung der Trityl Gruppe von Cystein-Rückstand erwies sich ein entscheidender Schritt für die anschließende Photoreaktion. Darüber hinaus dargestellt das Peptid Molekulargewicht vor und im Anschluss an die Reaktion erwies sich als identisch in Abbildung 6 b. Daher ist die Verwendung einer HPLC-Identifikation oder ein DTNB Assay erforderlich, um die Reaktion zu über…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Die Autoren erkennen finanziellen Unterstützung durch die Natural Science Foundation von China Grants (Nr. 21372023, 21778009 und 81701818); Das Ministerium für Wissenschaft und Technologie der Volksrepublik China (Nr. 2015DFA31590); die Shenzhen Science and Technology Innovation Committee (No. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 und GJHS20170310093122365); und die China Postdoc Wissenschaftsstiftung (Nr. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
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Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
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