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Química

Construcción de Thioether/sulfuro de vinilo-atado Hydrothiolation de péptidos helicoidales mediante foto-inducida tiol-eno/Ino

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Presentamos un protocolo para la construcción de vinilo thioether sulfuro atado helicoidales péptidos mediante foto-inducida tiol-ene/tiol-Ino hydrothiolation.

Abstract

Aquí, describimos un protocolo detallado para la preparación de péptidos thioether atado con hydrothiolation en resina intramolecular/intermoleculares tiol-ene. Además, este protocolo describe la preparación de péptidos vinilo-sulfuro-atado con hydrothiolation en solución tiol-Ino intramolecular entre residuos de cisteína y producto que poseen cadenas laterales de alkene/alquino en i, i + 4 posiciones. Péptidos lineales fueron sintetizados usando una síntesis de péptidos de fase sólida basado en el Fmoc estándar (SPPS). Tiol-ene hydrothiolation se lleva a cabo mediante una reacción intramolecular de thio-ene o una reacción intermolecular thio-ene, dependiendo de la longitud del péptido. En esta investigación se lleva a cabo una reacción intramolecular de thio-ene en el caso de péptidos más cortos utilizando en resina de desprotección de los grupos del trityl de después de la completa síntesis del péptido lineal de residuos de cisteína. La resina entonces se fija a la irradiación UV con fotoiniciador 4-methoxyacetophenone (mapa) y 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). La reacción intermolecular tiol-ene se lleva a cabo por Fmoc-Cys-OH se disuelve en un solvente de N, N– dimetilformamida (DMF). Esto es entonces reaccionó con el péptido utilizando el residuo de alkene-rodamiento en la resina. Después de eso, la macrolactamization se lleva a cabo utilizando hexafluorofosfato de benzotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (TOHB) y 4-Methylmorpholine (NMM) como reactivos de activación en la resina. Después de la macrolactamization, se continúa la síntesis de péptidos mediante SPPS estándar. En el caso de la hydrothiolation de thio-Ino, el péptido lineal es hendido de la resina, secado y posteriormente se disuelve en DMF desgasificada. Esto entonces se irradia con luz UV de fotoiniciador 2,2-dimetoxi-2-Fenilacetofenona (DMPA). Después de la reacción, DMF se evapora y el residuo crudo se precipita y purificado utilizando cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC). Estos métodos podrían funcionar para simplificar la generación de péptidos cíclicos thioether atado debido al uso de la química click thio-eno/Ino que posee grupo funcional superior tolerancia y buen rendimiento. La introducción de bonos thioether péptidos aprovecha la naturaleza nucleofílica de residuos de cisteína y es redox inertes con respecto a enlaces de disulfuro.

Introduction

El desarrollo de ligandos para modular las interacciones proteína-proteína (IBP) proporciona un enfoque atractivo para el descubrimiento de medicamentos modernos. Así, se ha invertido mucho esfuerzo en estudiar modalidades química novedosas que eficientemente podrían modular los IBP1,2,3. Protones generalmente consisten en superficies de interacción superficiales, grandes o descontinuadas, y pequeñas moléculas típicamente se consideran ligandos inadecuados para la modulación de los IBP4,5. Con una conveniente expuesta interacción superficie, péptidos cortos que mímico las características estructurales de las interfaces de proteínas representan los candidatos ideales para abordar este problema6,7. Sin embargo, los péptidos cortos son típicamente no estructurados en una solución acuosa. Esto es debido a que las moléculas de agua que compiten con la red de enlace de hidrógeno intramolecular del esqueleto peptídico y conformaciones bien definidas son entropically desfavorables en agua8. Además, los péptidos inherentemente baja estabilidad y propiedades de permeabilidad de la célula en gran medida limitan su uso en aplicaciones biológicas9,10. Según el análisis del Banco de datos (PDB) de proteínas, > 50% de los IBP implican interacciones de α-hélice corta11. Así, se han desarrollado diferentes métodos químicos con respecto a la estabilización de la hélice. Éstos incluyen disulfuro/thioether enlace formación12,13,14, ring-closing metathesis15, anillo de lactama formación16, “haga clic en” química17, además de perfluoroarenes18,19y de la formación de sulfuro de vinilo20.

Estabilizado los péptidos helicoidales se utilizan ampliamente para diversos objetivos intracelulares, como p53, estrógeno receptores, Ras, BCL-2 familia las proteínas y otros21,22,23,24. ALRN-6924, un hidrocarburo de todo grapado inhibidor dual de péptido de MDM2 y MDMX, está siendo usado para investigación clínica25. En los últimos años, nuestro grupo se ha centrado en el desarrollo de métodos de estabilización de novedoso péptido con tiol-ene y tiol-Ino reacciones26,27,28. En general, hemos demostrado que estas reacciones iniciadas por foto son eficientes condiciones suaves cuando naturalmente se utiliza abundante cisteína. Además, hemos demostrado que estas reacciones tienen una tolerancia excelente grupo funcional, son bio-orthogonal y ha demostrado para ser aplicable para péptidos y proteínas modificaciones29. Los péptidos resultantes de sulfuro atado thioether vinilo en gran medida mejoran el espacio químico de péptidos de restricción, ofrecen un centro de modificación en tether lábil y ha demostrado para ser aplicable para su uso en numerosas aplicaciones biológicas30 ,31,32. Hasta la fecha, se han descrito solamente limitados informes sobre la ciclación de péptidos tiol-ene/tiol-Ino. En un estudio publicado por Anseth et al. , en 2009, una reacción en resina intramolecular tiol-ene para la ciclación de péptidos entre alquenos activados con cisteína fue demostrado33. En el año 2015, Chou et al. se describe una reacción de dos componentes iniciado radical tiol-ene para péptido grapado34 y una reacción de acoplamiento de eno-Ino/tiol posterior, secuencial35. Recientemente, hemos descrito una serie de trabajos basados en vinilo thioether sulfuro atado péptidos20,26,27. Este protocolo describe una detallada síntesis de los péptidos de sulfuro atado de vinilo thioether mencionados en la esperanza de que sea útil para la comunidad de investigación.

Protocol

1. preparación de equipo Para el aparato de síntesis de péptidos manual, coloque un colector de vacío (Tabla de materiales) en una eficiente campana extractora. A continuación, colocar llaves de tres vías sobre el colector de vacío y conectar a una tubería de gas nitrógeno o argón. Todas las entradas no utilizadas mediante tabiques de goma de la tapa. Conectar columnas llenas de resina (0,8 x 4 cm, depósito de 10 mL, ver Tabla de materiales) al colector uti…

Representative Results

Los espectros de HPLC y MS del péptido Ac-y más5AAAC-NH2 y su producto ciclizados CA – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 que se generaron con la fotoreducción en resina intramolecular tiol-ene se representan en figura 6B. péptido cíclico fue encontrado para tener un peso molecular idéntico con respecto a su precursor lineal. Sin embargo, su tiempo de retención HPLC se observó que aproximadamente 2 minutos antes …

Discussion

En la ciclización de la resina en intramolecular thio-ene descrita en la figura 3, la eliminación del grupo trityl de un residuo de cisteína fue encontrada para ser un paso crítico para la fotoreducción posterior. Además, el peso molecular de péptidos antes y tras que la reacción fue encontrada para ser idéntico como representan en la Figura 6B. Por lo tanto, el uso de una identificación de HPLC o un ensayo DTNB es necesaria para el seguimiento de la r…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Los autores reconocen el apoyo financiero de la Fundación de subvenciones de China de Ciencias naturales (no. 21372023, 21778009 y 81701818); el Ministerio de ciencia y tecnología de la República Popular de China (Nº 2015DFA31590); el Shenzhen Ciencia y tecnología Comité de innovación (no. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 y GJHS20170310093122365); y la Fundación de ciencia Postdoctoral de China (no. 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
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Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

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ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
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Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
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