JoVE Journal > Chemistry
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Resultados
Discussion
Declarações
Acknowledgements
Materials
Referências
Tadução automática
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Química

Bygga Thioether/Vinyl sulfid-uppbundna spiralformade peptider Via foto-inducerad Thiol-ene/yne Hydrothiolation

Published: August 01, 2018
doi:
10.3791/57356
, , ,
1Key Laboratory of Chemical Genomics, School of Chemical Biology and Biotechnology,Peking University Shenzhen Graduate School

Summary

Vi presenterar ett protokoll för byggandet av thioether/vinyl sulfid-uppbundna spiralformade peptider med foto-inducerad thiol-ene/thiol-yne hydrothiolation.

Abstract

Här beskriver vi ett detaljerat protokoll för beredning av thioether-uppbundna peptider med på-harts intramolekylära/intermolekylära thiol-ene hydrothiolation. Det här protokollet beskriver dessutom utarbetandet av vinyl-sulfid-uppbundna peptider med i-lösning intramolekylära thiol-yne hydrothiolation mellan amino acids som besitter alkene/alkynen sida kedjor och cystein rester vid jag, jag + 4 positioner. Linjär peptider var syntetiseras med en standard Fmoc-baserade fasta fasen peptid syntes (SPPS). Thiol-ene hydrothiolation utförs med hjälp av en intramolekylära thio-ene reaktion eller en intermolekylära thio-ene reaktion, beroende på peptid längden. I denna forskning utförs en intramolekylära thio-ene reaktion när det gäller kortare peptider med på-harts deprotection trityl grupper av cystein rester efter komplett syntesen av den linjära peptiden. Kådan anges då UV-bestrålning med photoinitiator 4-methoxyacetophenone (karta) och 2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone (MMP). Intermolekylära thiol-ene reaktionen utförs av upplösning Fmoc-Cys-OH i ett N, N– dimetylformamid (DMF) lösningsmedel. Detta är då reagerade med peptiden med alkene-bärande återstoden på harts. Efter det utförs macrolactamization använda bensotriazol-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorofosfat (PyBop), 1-hydroxybenzotriazole (HoBt) och 4-Methylmorpholine (NMM) som aktivering reagens på kådan. Efter macrolactamization, peptidsyntesen är fortsatt använda standard SPPS. När det gäller den thio-yne hydrothiolation, är den linjära peptiden klyvs från kådan, torkat och därefter upplöstes avgasade DMF. Detta är sedan bestrålas med UV-ljus med photoinitiator 2,2-dimetoxi-2-phenylacetophenone (DMPA). Efter reaktionen, DMF indunstas och rå återstoden utfälls och renas med hjälp av högpresterande vätskekromatografi (HPLC). Dessa metoder kan fungera för att förenkla generationen av thioether-uppbundna cykliska peptider på grund av användning av thio-ene/yne Klicka kemi som äger överlägsen funktionell grupp tolerans och god avkastning. Införandet av thioether obligationer i peptider tar fördel av nukleofil naturen av cystein rester och är redox-inert i förhållande till disulfide obligationer.

Introduction

Utvecklingen av ligander till modulera protein-protein interaktioner (PPI) ger en attraktiv metod för moderna läkemedelsutveckling. Således har en stor ansträngning investerats i att studera nya kemiska modaliteter som effektivt kunde modulera protonpumpshämmare1,2,3. Protonpumpshämmare består vanligen av grunt, stora eller avvecklad samverkande ytor och små molekyler normalt anses olämpliga ligander för moduleringen av protonpumpshämmare4,5. Med en lämplig exponerade samverkande yta representerar kort peptider som efterliknar strukturella drag hos protein-gränssnitt perfekta kandidater att ta itu med detta problem6,7. Kort peptider är dock normalt ostrukturerad i vattenlösning. Detta är på grund av att vattenmolekyler som konkurrerar med de intramolekylära väte bindning nätverket av peptid ryggraden och väldefinierade konformationer är entropically unfavorable i vatten8. Dessutom peptiderna låg inneboende stabilitet och permeabilitet Cellegenskaper i hög grad begränsa deras användning i biologiska program9,10. Enligt protein data bank (PDB) analys, > 50% av protonpumpshämmare innebär kort α-helix interaktioner11. Således har olika kemiska metoder utvecklats när det gäller helix stabilisering. Dessa inkluderar disulfid/thioether bond bildandet12,13,14, ringen-stängning metates15, lactam ringen bildandet16, ”klicka” kemi17, tillägg av perfluoroarenes18,19och vinyl-svavelväte bildas20.

Stabiliserad spiralformade peptider är allmänt utnyttjas för olika intracellulära mål, inklusive p53, östrogen receptorer, Ras, BCL-2 familj proteiner, och andra21,22,23,24. ALRN-6924, en all-kolväte häftade peptid dubbla hämmare av MDM2 och MDMX, används för närvarande för klinisk utredning25. I de senaste åren, har vår grupp fokuserat på utvecklingen av romanen peptid stabilisering metoder använder thiol-ene och thiol-yne reaktioner26,27,28. I allmänhet har vi visat att dessa foto-initierade biverkningar är effektiva under milda förhållanden när naturligt rikligt cystein används. Vi har dessutom visat att dessa reaktioner har en utmärkt funktionell grupp tolerans, är bio-ortogonala och har visat sig vara tillämpliga för peptid- och ändringar29. De resulterande thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptiderna i hög grad förbättra det kemiska utrymmet tvang peptider, ger ett instabilt på-tether modifiering center och har visat sig vara tillämpligt för bruk i många biologiska applikationer30 ,31,32. Hittills har har endast begränsad rapporter beskrivits angående thiol-ene/thiol-yne peptid ringbildning. I en studie publicerad av Anseth et al. 2009, var en på-harts intramolekylära thiol-ene reaktion för peptid ringbildning mellan aktiverade alkener med cystein visat33. Under 2015 Chou et al. beskrivs en tvåkomponents radikala initierade thiol-ene reaktion för peptid häftning34 och en efterföljande, sekventiell thiol-yne/ene koppling reaktion35. Nyligen har beskrivit vi en rad verk baserat på thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptider20,26,27. Det här protokollet beskriver en detaljerad sammanfattning av de ovannämnda thioether/vinyl svavelväte uppbundna peptiderna i förhoppning att det kommer att vara till hjälp för bredare forskarsamhället.

Protocol

1. utrustning förberedelse För manuell peptid-syntes apparatur, placera ett vakuum samlingsrör (Tabell för material) i en effektiv spiskåpa. Nästa, placera trevägs Avstängningskranar på vakuum grenröret och ansluta dem till en kväve eller argon gas. Cap alla oanvända vikar med gummi septa. Anslut harts fyllda kolumner (0,8 x 4 cm, 10 mL behållare, se Tabell för material) till grenröret med de tre-vägs Avstängningskranar (figur 1</…

Representative Results

De HPLC och MS-spektra av peptiden Ac-Guitar5AAAC-NH2 och dess cyclized produkt Ac – Y-(cyclo-1,5)-[mS5AAAC] – NH2 som genererades med på-harts intramolekylära thiol-ene är skildras i figur 6b. den cykliska peptiden upptäcktes att en identisk molekylvikt i förhållande till dess linjära föregångare. Dess HPLC retentionstiden observerades dock vara cirka 2 min tidigare än sina föregångare på samma separat…

Discussion

I på-harts intramolekylära thio-ene ringbildning beskrivs i figur 3, befanns avlägsnande av gruppen trityl av en cysteinrest vara ett viktigt steg för den efterföljande är. Dessutom avbildas peptid molekylvikten före och efter reaktionen befanns vara identiska som i figur 6B. Därför krävs användning av en HPLC-identifiering eller ett DTNB-test för att övervaka reaktionen. När det gäller intermolekylära thio-ene reaktionen beskrivs i <strong class…

Declarações

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna erkänner finansiellt stöd från de naturvetenskap Foundation av Kina bidrag (nr 21372023, 21778009 och 81701818); Ministeriet för vetenskap och teknik av folkets republik av Kina (nr. 2015DFA31590); Shenzhen vetenskap och teknik Innovation kommittén (nr. JCYJ20170412150719814, JCYJ20170412150609690, JCYJ20150403101146313, JCYJ20160301111338144, JCYJ20160331115853521, JSGG20160301095829250 och GJHS20170310093122365); och Kina postdoktorala Science Foundation (nr 2017 M 610704).

Materials

Rink Amide MBHA resin(0.53 mmol/g) HECHENG GRM50407
Standard Fmoc-protected amino acids GL Biochem (Shanghai) Ltd.
N-Methyl-2-pyrrolidinone Shenzhen endi Biotechnology Co.Ltd. 3230 skin harmful
N,N-Dimethyl formamide Energy B020051 skin harmful
Dichloromethane Energy W330229 skin harmful
N,N-Diisoproylethylamine Aldrich 9578 irritant
Trifluoroacetic acid J&K 101398 corrosive
Triisopropylsilane J&K 973821
1,2-Ethanedithiol J&K 248897 Stench
2-(6-Chloro-1H-benzotriazole-1-yl)-1,1,3,3-tetramethylaminium hexafluorophosphate  GL Biochem (Shanghai) Ltd. 851012
Morpholine Aldrich M109062 irritant
Diethyl ether Aldrich 673811 flammable
Acetonitrile Aldrich 9758 toxicity
Methanol Aldrich 9758 toxicity
2-hydroxy-1-[4-(2-hydroxyethoxy)-phenyl]-2-methyl-1-propanone Energy A050035
4-methoxyacetophenone Energy A050098
2,2-dimethoxy-2-phenylacetophenone Energy D070132
5,5'-Dithiobis-(2-nitrobenzoic acid) J&K 281281
Benzotriazole-1-yl-oxytripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate Energy E020172
1-Hydroxybenzotriazole Energy D050256
4-Methylmorpholine Energy W320038
High Performance Liquid Chromatography SHIMADZU LC-30AD
Electrospray Ionization Mass SHIMADZU LCMS-8030
Lyophilizer Labconco FreeZone
SpeedVac concentration system Thermo Savant
vacuum manifold promega A7231
three-way stopcocks Bio-Rad 7328107
poly-prep chromatography columns  Bio-Rad 7311550
DOWNLOAD MATERIALS LIST

Referências

  1. Pelay-Gimeno, M., Glas, A., Koch, O., Grossmann, T. N. Structure-based design of inhibitors of protein-protein interactions: mimicking peptide binding epitopes. Angewandte Chemie International Edition. 54 (31), 8896-8927 (2015).
  2. Passioura, T., Katoh, T., Goto, Y., Suga, H. Selection-based discovery of druglike macrocyclic peptides. Annual Review of Biochemistry. 83, 727-752 (2014).
  3. Gonzalez, M. W., Kann, M. G. Protein interactions and disease. PLoS Computational Biology. 8 (12), 1-11 (2012).
  4. Wilson, A. J. Inhibition of protein-protein interactions using designed molecules. Chemical Society Reviews. 38 (12), 3289-3300 (2009).
  5. Teresa, A. F. C., Alessio, C. Cyclic and macrocyclic peptides as chemical tools to recognise protein surfaces and probe protein-protein interactions. ChemMedChem. 11 (8), 787-794 (2016).
  6. Craik, D. J., Fairlie, D. P., Liras, S., Price, D. The future of peptide-based drugs. Chemical Biology & Drug Design. 81 (1), 136-147 (2013).
  7. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  8. Zhang, Q. Z., Tian, Y., Lao, Y. Z., Li, Z. G. Peptides-staple method development and its application in cancer therapy. Current Medicinal Chemistry. 21 (21), 2438-2452 (2014).
  9. Cromm, P. M., Spiegel, J., Grossmann, T. N. Hydrocarbon stapled peptides as modulators of biological function. ACS Chemical Biology. 10 (6), 1362-1375 (2015).
  10. Wang, D., Liao, W., Arora, P. S. Enhanced metabolic stability and protein-binding properties of artificial alpha helices derived from a hydrogen-bond surrogate: application to Bcl-xL. Angewandte Chemie International Edition. 44 (40), 6525-6529 (2005).
  11. Bullock, B. N., Jochim, A. L., Arora, P. S. Assessing helical protein interfaces for inhibitor design. Journal of the American Chemical Society. 133, 14220-14223 (2011).
  12. Jackson, D. Y., King, D. S., Chmielewski, J., Singh, S., Schultz, P. G. General approach to the synthesis of short α-helical peptides. Journal of the American Chemical Society. 113 (24), 9391-9392 (1991).
  13. Timmerman, P., Beld, J., Puijk, W. C., Meloen, R. H. Rapid and quantitative cyclization of multiple peptide loops onto synthetic scaffolds for structural mimicry of protein surfaces. ChemBioChem. 6 (5), 821-824 (2005).
  14. Muppidi, A., Wang, Z., Li, X., Chen, J., Lin, Q. Achieving cell penetration with distance-matching cysteine cross-linkers: a facile route to cell-permeable peptide dual inhibitors of Mdm2/Mdmx. Chemical Communications. 47 (33), 9396-9398 (2011).
  15. Schafmeister, C. E., Po, J., Verdine, G. L. An all-hydrocarbon cross-linking system for enhancing the helicity and metabolic stability of peptides. Journal of the American Chemical Society. 122 (24), 5891-5892 (2000).
  16. Osapay, G., Taylor, J. W. Multicyclic polypeptide model compounds. 1. synthesis of a tricyclic amphiphilic alpha-helical peptide using an oxime resin, segment-condensation approach. Journal of the American Chemical Society. 112 (16), 6046-6051 (1990).
  17. Lau, Y. H., Andrade, d. P., Wu, Y., Spring, D. R. Peptide stapling techniques based on different macrocyclisation chemistries. Chemical Society Reviews. 44 (1), 91-102 (2015).
  18. Spokoyny, A. M., Zou, Y., Ling, J. J., Yu, H., Lin, Y. S., Pentelute, B. L. A perfluoroaryl-cysteine S(N)Ar chemistry approach to unprotected peptide stapling. Journal of the American Chemical Society. 135 (16), 5946-5949 (2013).
  19. Lautrette, G., Touti, F., Lee, H. G., Dai, P., Pentelute, B. L. Nitrogen arylation for macrocyclization of unprotected peptides. Journal of the American Chemical Society. 138 (27), 8340-8343 (2016).
  20. Tian, Y., et al. Stapling of unprotected helical peptides via photoinduced intramolecular thiol-yne hydrothiolation. Chemical Science. 7 (5), 3325-3330 (2016).
  21. Chang, Y. S., et al. Stapled α-helical peptide drug development: a potent dual inhibitor of MDM2 and MDMX for p53-dependent cancer therapy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (36), 3445-3454 (2013).
  22. Zhao, H., et al. Crosslinked aspartic acids as helix-nucleating templates. Angewandte Chemie International Edition. 55 (39), 12088-12093 (2016).
  23. Leshchiner, E. S., et al. Direct inhibition of oncogenic KRAS by hydrocarbon-stapled SOS1 helices. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (6), 1761-1766 (2015).
  24. Wang, D., Qin, X., Zhao, H., Li, Z. N-cap helix nucleation: methods and their applications. Science China Chemistry. 60 (6), 689-700 (2017).
  25. Zorzi, A., Deyle, K., Heinis, C. Cyclic peptide therapeutics: past, present and future. Current Opinion in Chemical Biology. 38, 24-29 (2017).
  26. Hu, K., et al. An in-tether chiral center modulates the helicity, cell permeability, and target binding affinity of a peptide. Angewandte Chemie International Edition. 55 (28), 8013-8017 (2016).
  27. Lin, H., Jiang, Y., Zhang, Q., Hu, K., Li, Z. An in-tether sulfilimine chiral center induces helicity in short peptides. Chemical Communications. 52 (68), 10389-10391 (2016).
  28. Zhao, B., Zhang, Q., Li, Z. Constructing thioether-tethered cyclic peptides via on-resin intra-molecular thiol-ene reaction. Journal of Peptide Science. 22 (8), 540-544 (2016).
  29. Dondoni, A., Massi, A., Nanni, P., Roda, A. A new ligation strategy for peptide and protein glycosylation: photoinduced thiol-ene coupling. Química. 15 (43), 11444-11449 (2009).
  30. Hu, K., Sun, C., Li, Z. Reversible and versatile on-tether modification of chiral-center-induced helical peptides. Bioconjugate Chemistry. 28 (7), 2001-2007 (2017).
  31. Shi, X., Jiang, Y., Yang, D., Zhao, H., Tian, Y., Li, Z. Reversibly switching the conformation of short peptide through in-tether chiral sulfonium auxiliary. Chinese Chemical Letters. , (2017).
  32. Jiang, Y., et al. Switching substitution groups on the in-tether chiral centre influences backbone peptides’ permeability and target binding affinity. Organic & Biomolecular Chemistry. 15 (3), 541-544 (2017).
  33. Aimetti, A. A., Shoemaker, R. K., Lin, C. C., Anseth, K. S. On-resin peptide macrocyclization using thiol-ene click chemistry. Chemical Communications. 46 (23), 4061-4063 (2010).
  34. Wang, Y. X., Chou, D. H. C. A thiol-ene coupling approach to native peptide stapling and macrocyclization. Angewandte Chemie International Edition. 54 (37), 10931-10934 (2015).
  35. Wang, Y., et al. Application of thiol-yne/thiol-ene reactions for peptide and protein macrocyclizations. Química. 23 (29), 7087-7092 (2017).
  36. Patgiri, A., Menzenski, M. Z., Mahon, A. B., Arora, P. S. Solid-phase synthesis of short α-helices stabilized by the hydrogen bond surrogate approach. Nature Protocols. 5 (11), 1857-1865 (2010).
  37. Ozyurek, M., Baki, S., Gungor, N., Celik, S. E., Guclu, K., Apak, R. Determination of biothiols by a novel on-line HPLC-DTNB assay with post-column detection. Analytica Chimica Acta. 750, 173-181 (2012).
  38. Zhang, Q. Z., et al. Chiral sulfoxide-induced single turn peptide α-helicity. Scientific Reports. 6, 38573 (2016).
  39. Lin, H., et al. An in-tether sulfilimine chiral center induces beta-turn conformation in short peptides. Organic & Biomolecular Chemistry. 14 (42), 9993-9999 (2016).
  40. Hu, K., Li, W., Yu, M., Sun, C., Li, Z. Investigation of cellular uptakes of the in-tether chiral-center-induced helical pentapeptides. Bioconjugate Chemistry. 27 (12), 2824-2827 (2016).
  41. Hu, K., et al. A precisely positioned chiral center in an i, i + 7 tether modulates the helicity of the backbone peptide. Chemical Communications. 53 (50), 6728-6731 (2017).
  42. Li, J., et al. An in-tether chiral center modulates the proapoptotic activity of the KLA peptide. Chemical Communications. 53 (75), 10452-10455 (2017).
  43. Zhao, B., et al. A thioether-stabilized-D-proline-L-proline-induced β-hairpin peptide of defensin segment increases its anti-Candida albicans ability. ChemBioChem. 17 (15), 1416-1420 (2016).
  44. Tian, Y., Yang, D., Ye, X., Li, Z. Thioether-derived macrocycle for peptide secondary structure fixation. The Chemical Record. 17 (9), 874-885 (2017).
  45. Hu, K., Yin, F., Yu, M., Sun, C., Li, J., Liang, Y., Li, W., Xie, M., Lao, Y., Liang, W., Li, Z. G. In-tether chiral center induced helical peptide modulators target p53-MDM2/MDMX and inhibit tumor growth in stem-like cancer cell. Theranostics. 7 (18), 4566-4576 (2017).
  46. Tian, Y., Jiang, Y., Li, J., Wang, D., Zhao, H., Li, Z. Effect of stapling architecture on physiochemical properties and cell permeability of stapled α-helical peptides: a comparative study. ChemBioChem. 18 (21), 2087-2093 (2017).

Tags

ThioetherVinyl SulfideHelical PeptidesPhoto-induced Thiol-ene/yne Hydro-thiolationRink Amide MBHA ResinFmoc DeprotectionHCTUDIPEATrityl DeprotectionSolid-phase Peptide Synthesis
check_url/pt/57356?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Citar este artigo
Shi, X., Liu, Y., Zhao, R., Li, Z. Constructing Thioether/Vinyl Sulfide-tethered Helical Peptides Via Photo-induced Thiol-ene/yne Hydrothiolation. J. Vis. Exp. (138), e57356, doi:10.3791/57356 (2018).
Baixar citação
Reimpressões e Permissões

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image