Opførelsen af syntetiske Phage vises Fab bibliotek med skræddersyede mangfoldighed
Summary
Denne protokol beskriver en detaljeret procedure for opførelsen af en phage-vises syntetisk antistof bibliotek med skræddersyede mangfoldighed. Syntetisk antistoffer har bredt programmer fra grundforskning til sygdom diagnostik og terapi.
Abstract
Behovet for monoklonale antistoffer (papagøjesyge) i grundforskning og medicin stiger årligt. Hybridom teknologi har været den dominerende metode til mAb udvikling siden sin første rapport i 1975. Som en alternativ teknologi er phage display metoder for mAb udvikling i stigende grad attraktivt da Humira, den første phage-afledte antistof og en af de bedst sælgende mAbs, blev godkendt for klinisk behandling af reumatoid arthritis i 2002. Som en ikke-animalsk baseret mAb udvikling teknologi, omgår phage display antigen immunogenicitet, menneskeliggørelse og animalske vedligeholdelse, der kræves fra traditionelle hybridom teknologi baseret antistof udvikling. I denne protokol beskriver vi en metode til konstruktion af syntetiske phage-vises Fab biblioteker med EDD 109-1010 fås med en enkelt elektroporation. Denne protokol består af: 1) højeffektiv electro-kompetente celle forberedelse; 2) udvinding af uracil-holdige enkeltstrenget DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese; 4) elektroporation og beregning af bibliotek størrelse; 5) protein A/L-baserede enzym-forbundet immunosorbent assay (ELISA) for foldning og funktionelle mangfoldighed evaluering; og 6) DNA Sekvensanalyse af forskellighed.
Introduction
mAbs har bredt programmer lige fra grundforskning til sygdom diagnostik og terapi. I 2016, er mere end 60 mAbs blevet godkendt af USA ‘s Food and Drug Administration (USFDA) til klinisk behandling af autoimmune sygdomme, cancer og infektionssygdomme1,2.
I 1975 rapporterede Kohler og Milstein en teknik til kontinuerlig produktion af antistoffer af en enkelt klonede specificitet fra en cellulær kilde omtales som ‘hybridomer’ og denne teknik er efterfølgende blevet en hjørnesten i medicin og industri3 ,4. Generation af mAbs ved denne metode kræver forskellige foranstaltninger herunder antigen produktion, mus immunisering, udvinding af B-lymfocytter, fusion af B-celler med myelomatose celler til at danne udødelige hybridom celler, klon udvalg, og til terapeutisk anvendelse, menneskeliggørelse er forpligtet til at undgå menneskelig anti-mus antistof (HAMA)4,5. Men for denne teknologi, antigener herunder toksiner, patogener og meget velbevarede proteiner er relativt ineffektive i udløser en i vivo immunrespons for mAb produktion5.
I 1978 rapporterede Hutchison et al. brugen af en oligonukleotid til direkte mutagenese af rester i en enkelt-strenget bacteriophage virus6. I 1985 rapporterede Smith, at udenlandske gen fragmenter kan være smeltet i rammen med det gen, der koder phage frakke protein III og kan således vises på phage overflade uden akkord dens smitteevne7. Disse pionérarbejde lagt et fundament for den efterfølgende opførelse af phage-vises antistof biblioteker i immun, naiv, og syntetisk danner med formater af single-kæde variable fragment (scFv) og antigen-bindende fragment (Fab) for terapeutisk mAb udvikling8,9. Fra et teknisk synspunkt phage display-baserede antistof udvikling tilbyder en supplerende tilgang til hybridom-baserede mAb udvikling, der kan bidrage til at omgå de begrænsninger, nogle antigener kan udgøre og menneskeliggørelse proces, der hybridom-afledte antistoffer kræver ofte5. I 2016, 6 phage display-afledte mAbs er blevet godkendt på markedet herunder Humira, en af de mest succesfulde mAbs anvendes til behandling af reumatoid arthritis, og mange phage display-afledte antistof kandidater er i øjeblikket på forskellige stadier af kliniske undersøgelsen10.
For immunforsvaret og naive phage antistof biblioteker, mangfoldighed af komplementaritet-bestemmende områder (CdR) i lette og tunge kæde er afledt fra naturlige immun repertoire (dvs.fra B-celler). Derimod er mangfoldighed af CDR i syntetisk phage antistof biblioteker helt kunstig. Syntetisk tilgange til biblioteket konstruktion giver præcis kontrol over design af sekvens mangfoldighed og muligheder for Mekanistiske undersøgelser af antistof struktur og funktion11,12. Desuden kan rammer for syntetisk biblioteker optimeres før bibliotek opbygning at lette nedstrøms, omfattende industriel udvikling11,12.
I 1985, Kunkel rapporterede en enkeltstrenget DNA (ssDNA) skabelon-baseret mutagenese tilgang at indføre site-directed mutationer i M13 bacteriophage effektivt13. Denne tilgang blev efterfølgende anvendes bredt til opførelse af phage-vises biblioteker. Kemisk syntetiseret DNA oligonukleotider designet til at indføre mangfoldighed i Fab CdR er indarbejdet i et phagemid med et antistof rygraden skabelon. I denne proces, phagemid er udtrykt som en uracil-holdige ssDNA (dU-ssDNA) og oligonukleotider udglødet på en CDR og udvidet til at syntetisere dobbelt-strenget DNA (dsDNA) T7 DNA polymerase og T4 DNA ligase. Endelig kan genererede ds-DNA føres ind Escherichia coli af elektroporation.
Høj mangfoldighed, phage-vises bibliotek opbygning, høj spænding elektroporation af en to-komponent blanding af electro-kompetente celler og kovalent bør lukkede cirkulære dsDNA (CCC-dsDNA) forberedes omhyggeligt. Sidhu et al. ændrede forberedelse af electro-kompetente celler og DNA fra traditionelle metoder og stærkt forbedret bibliotek mangfoldighed14.
I denne protokol beskriver vi en metode til konstruktion af syntetiske phage-vises Fab biblioteker med EDD 109-1010 fås med en enkelt elektroporation. Figur 1 viser en oversigt over biblioteket konstruktion herunder: 1) højeffektiv electro-kompetente celle forberedelse; 2) udvinding af dU-ssDNA; 3) Kunkel metode baseret oligonukleotid-directed mutagenese; 4) elektroporation og beregning af bibliotek størrelse; 5) protein A/L-baserede ELISA for foldning og funktionelle mangfoldighed evaluering; og 6) DNA Sekvensanalyse af forskellighed. Alle reagenser, stammer og udstyr er angivet i materialets tabel. Tabel 1 viser opsætningen reagens.
Protocol
Representative Results
Discussion
For at konstruere høj diversitet, phage-vises Fab biblioteker, kvalitetskontrol check point er nødvendige for at overvåge forskellige stadier af byggeprocessen, herunder kompetenceudvikling af electro-kompetente celler, kvaliteten af dU-ssDNA skabelon, effektiviteten af CCC-dsDNA syntese, titer efter elektroporation, Fab foldning og aminosyre mangfoldighed af CdR af Sekvensanalyse af Fab-phage kloner.
Højt udbytte og renheden af dU-ssDNA er afgørende for høj mutagenese sats. Vores erfari…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne værdsætter Dr. Frederic Fellouse fra Sidhu lab for kritiske kommentarer på Kunkels metode baseret syntetisk Fab phage bibliotek konstruktion. Forfatterne forstår Mrs Alevtina Pavlenco og andre medlemmer fra Sidhu lab for værdifuld hjælp til at forberede højeffektiv electro-kompetente E. coli celler og høj kvalitet dU-ssDNA. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) til DW og ved ShanghaiTech Universitet (Grant No.: F-0301-13-005) til laboratoriet af antistof Engineering.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referências
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
