Bouw van synthetische Phage weergegeven Fab bibliotheek met op maat gemaakte diversiteit
Summary
Dit protocol beschrijft een gedetailleerde procedure voor de bouw van een bibliotheek van synthetische antilichaam faag-weergegeven met op maat gemaakte diversiteit. Synthetische antilichamen hebben brede toepassingen van fundamenteel onderzoek om de diagnose van de ziekte en therapeutics.
Abstract
Vraag naar monoclonal antilichamen (mAbs) in fundamenteel onderzoek en geneeskunde groeit jaarlijks. Hybridoma technologie is de dominante methode voor mAb development sinds haar eerste verslag in 1975. Als een alternatieve technologie zijn faag display methoden voor mAb ontwikkeling steeds aantrekkelijker omdat Humira, het eerste faag afkomstige antilichaam en één van de best verkochte mAbs, goedgekeurd voor de klinische behandeling van reumatoïde artritis in 2002. Als een proefdiervrije mAb ontwikkeling technologie gebaseerde, mijdt faag display antigeen immunogeniciteit, humanisering en dierlijke onderhoud die worden vereist van de ontwikkeling van het antilichaam van de technologie op basis van traditionele hybridoma. In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Dit protocol bestaat uit: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van uracil-bevattende single-stranded DNA (dU-ssDNA); 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit.
Introduction
mAbs heeft brede toepassingen variërend van fundamenteel onderzoek tot de diagnose van de ziekte en therapeutics. Vanaf 2016 zijn meer dan 60 mAbs goedgekeurd door de Amerikaanse Food and Drug Administration (USFDA) voor de klinische behandeling van auto-immuunziekten, kanker en infectieziekten1,2.
In 1975 rapporteerde Kohler en Milstein een techniek voor de continue generatie van antilichamen van een enkele klonen specificiteit van een cellulaire bron aangeduid als ‘hybridomas’ en deze techniek is later uitgegroeid tot een hoeksteen in geneeskunde en industrie3 ,4. Generatie van mAbs door deze methode vereist een paar stappen, met inbegrip van de productie van antigeen muis immunisatie, winning van B-lymfocyten, fusie van B-cellen met myeloma cellen vormen onsterfelijke hybridoma cellen, selectie van de kloon, en voor therapeutische toepassingen, humanisering is vereist om te voorkomen dat menselijke anti-muis-antilichamen (HAMA)4,5. Echter, voor deze technologie, antigenen met inbegrip van toxines, pathogenen en zeer geconserveerde eiwitten zijn relatief niet effectief in het genereren van een immuunrespons in vivo voor mAb productie5.
In 1978 gemeld Hutchison et al. het gebruik van een oligonucleotide aan directe mutagenese van een residu in een single-stranded bacteriofaag virus6. In 1985, Smith gemeld dat buitenlandse gene fragmenten kunnen worden gesmolten in het frame met het gen codering faag vacht eiwit III en kunnen dus worden weergegeven op het oppervlak van de bacteriofaag zonder afbreuk te doen aan haar infectiviteit7. Deze baanbrekende werken een basis gelegd voor de latere aanleg van phage-weergegeven antilichaam bibliotheken in immuun, naïef, en synthetische vormt met de formaten van single-keten variabele fragment (scFv) en antigeen-bindende fragment (Fab) voor therapeutische mAb development8,9. Van de technisch oogpunt, de ontwikkeling van het antilichaam weergave gebaseerde van de bacteriofaag biedt een complementaire benadering van hybridoma gebaseerde mAb ontwikkeling dat bijdragen kan tot het omzeilen van de beperkingen die sommige antigenen kunnen opleveren en de humanisering proces dat hybridoma afkomstige antilichamen vereisen vaak5. Vanaf 2016, 6 faag display afkomstige mAbs zijn goedgekeurd in de markt met inbegrip van Humira, een van de meest succesvolle mAbs gebruikt voor de behandeling van reumatoïde artritis, en vele faag display afkomstige antilichaam kandidaten zijn momenteel in diverse stadia van klinische onderzoek10.
Voor immuun- en naïef faag antilichaam bibliotheken, de diversiteit van complementariteit-bepalen regio’s (CDR) in lichte en zware keten is afgeleid van het natuurlijke immuunsysteem repertoire (d.w.z., van B-cellen). De diversiteit van CDR in synthetische faag antilichaam bibliotheken is daarentegen volledig kunstmatige. Synthetische benaderingen van bibliotheek bouw bieden nauwkeurige controle over het ontwerp van de reeks diversiteit en bieden mogelijkheden voor mechanistische studies van antilichaam structuur en werken11,12. Bovendien kan het kader voor synthetische bibliotheken worden geoptimaliseerd voor bibliotheek bouw om stroomafwaarts, grootschalige industriële ontwikkeling11,12.
In 1985, Kunkel rapporteerde een single-stranded DNA (ssDNA) mutagenese sjabloon gebaseerde benadering om plaats-geleide mutaties in M13 bacteriofaag efficiënt13. Deze aanpak werd vervolgens op grote schaal gebruikt voor de bouw van bibliotheken faag-weergegeven. Chemisch gesynthetiseerd DNA oligonucleotides ontworpen om diversiteit in Fab CDR worden opgenomen in een phagemid met een antilichaam ruggengraat sjabloon. In dit proces, de phagemid wordt uitgedrukt als een uracil-bevattende ssDNA (dU-ssDNA) en de oligonucleotides worden gegloeid op de CDR en verruimd en double-stranded DNA (dsDNA) in aanwezigheid van DNA van T7 polymerase en T4 DNA ligase synthetiseren. Tot slot kan gegenereerde ds-DNA in Escherichia coli door electroporation worden binnengebracht.
Voor hoge diversiteit, faag-weergegeven bibliotheek bouw, hoog-voltage electroporation van een tweecomponenten mengsel van electro-bevoegde cellen en covalent moet gesloten circulaire dsDNA (CCC-dsDNA) zorgvuldig worden voorbereid. Sidhu et al. bewerkt voor de bereiding van electro-bevoegde cellen en DNA op basis van traditionele methoden en sterk verbeterde bibliotheek diversiteit14.
In dit protocol beschrijven we een methode voor de bouw van synthetische faag-weergegeven Fab bibliotheken met diversiteit van 109-1010 verkrijgbaar met een enkel electroporation. Figuur 1 toont een overzicht van de bibliotheek bouw waaronder: 1) hoogrendabele electro-bevoegde cel voorbereiding; 2) extractie van dU-ssDNA; 3) Kunkel methode gebaseerd oligonucleotide gerichte mutagenese; 4) electroporation en berekening van de grootte van de bibliotheek; 5) eiwit A/L gebaseerde ELISA voor het vouwen en functionele diversiteit evaluatie; en 6) DNA sequentieanalyse van diversiteit. In de materiaal tabelstaan alle reagentia, stammen en apparatuur. Tabel 1 toont de reagens setup.
Protocol
Representative Results
Discussion
Voor de bouw van hoge diversiteit, faag-weergegeven Fab Bibliotheken, kwaliteitscontrole zijn controleposten nodig om te controleren van de verschillende fasen van het bouwproces, met inbegrip van de bevoegdheid van electro-bevoegde cellen, kwaliteit van de dU-ssDNA-sjabloon, efficiëntie van CCC-dsDNA synthese, titer na electroporation, Fab vouwen en diversiteit van het aminozuur van CDR door sequentieanalyse van Fab-faag klonen.
Hoge opbrengst en zuiverheid van de dU-ssDNA is essentieel voor…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs waarderen Dr. Frederic Fellouse van het Sidhu laboratorium voor kritische opmerkingen over Kunkel van methode gebaseerd synthetische Fab faag bibliotheek bouw. De auteurs waarderen Mrs. Alevtina Pavlenco en andere leden van de Sidhu lab voor waardevolle hulp van de voorbereiding van hoogrenderende electro-bevoegde E. coli cellen en hoge kwaliteit dU-ssDNA. Dit werk werd gesteund door de National Natural Science Foundation of China (Grant No.: 81572698, 31771006) DW en door ShanghaiTech University (Grant No.: F-0301-13-005) laboratorium van antilichaam engineering.
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referências
- Singh, S., et al. Monoclonal Antibodies: A Review. Curr Clin Pharmacol. , (2017).
- Reichert, J. M. Antibodies to watch in 2017. MAbs. 9 (2), 167-181 (2017).
- Kohler, G., Milstein, C. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature. 256 (5517), 495-497 (1975).
- Milstein, C. The hybridoma revolution: an offshoot of basic research. Bioessays. 21 (11), 966-973 (1999).
- Gray, A. C., Sidhu, S. S., Chandrasekera, P. C., Hendriksen, C. F., Borrebaeck, C. A. Animal-Friendly Affinity Reagents: Replacing the Needless in the Haystack. Trends Biotechnol. 34 (12), 960-969 (2016).
- Hutchison, C. A., et al. Mutagenesis at a specific position in a DNA sequence. J Biol Chem. 253 (18), 6551-6560 (1978).
- Smith, G. P. Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface. Science. 228 (4705), 1315-1317 (1985).
- Sidhu, S. S. . Phage Display in Biotechnology and Drug Discovery. , (2005).
- Weiss, G. A., Watanabe, C. K., Zhong, A., Goddard, A., Sidhu, S. S. Rapid mapping of protein functional epitopes by combinatorial alanine scanning. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (16), 8950-8954 (2000).
- Frenzel, A., Schirrmann, T., Hust, M. Phage display-derived human antibodies in clinical development and therapy. MAbs. 8 (7), 1177-1194 (2016).
- Sidhu, S. S., Fellouse, F. A. Synthetic therapeutic antibodies. Nat Chem Biol. 2 (12), 682-688 (2006).
- Adams, J. J., Sidhu, S. S. Synthetic antibody technologies. Curr Opin Struct Biol. 24, 1-9 (2014).
- Kunkel, T. A. Rapid and efficient site-specific mutagenesis without phenotypic selection. Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (2), 488-492 (1985).
- Sidhu, S. S., Lowman, H. B., Cunningham, B. C., Wells, J. A. Phage display for selection of novel binding peptides. Methods Enzymol. 328, 333-363 (2000).
- Persson, H., et al. CDR-H3 diversity is not required for antigen recognition by synthetic antibodies. J Mol Biol. 425 (4), 803-811 (2013).
- Lefranc, M. P., et al. IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains. Dev Comp Immunol. 27 (1), 55-77 (2003).
- Graille, M., et al. Complex between Peptostreptococcus magnus protein L and a human antibody reveals structural convergence in the interaction modes of Fab binding proteins. Structure. 9 (8), 679-687 (2001).
- Graille, M., et al. Crystal structure of a Staphylococcus aureus protein A domain complexed with the Fab fragment of a human IgM antibody: structural basis for recognition of B-cell receptors and superantigen activity. Proc Natl Acad Sci U S A. 97 (10), 5399-5404 (2000).
- Huang, R., Fang, P., Kay, B. K. Improvements to the Kunkel mutagenesis protocol for constructing primary and secondary phage-display libraries. Methods. 58 (1), 10-17 (2012).
- Chen, G., Sidhu, S. S. Design and generation of synthetic antibody libraries for phage display. Methods Mol Biol. 1131, 113-131 (2014).
- Padlan, E. A. Anatomy of the antibody molecule. Mol Immunol. 31 (3), 169-217 (1994).
- Virnekas, B., et al. Trinucleotide phosphoramidites: ideal reagents for the synthesis of mixed oligonucleotides for random mutagenesis. Nucleic Acids Res. 22 (25), 5600-5607 (1994).
- Fellouse, F. A., Sidhu, S. S. . Making and Using Antibodies: A Practical Handbook. , 157-180 (2006).
- Fantini, M., et al. Assessment of antibody library diversity through next generation sequencing and technical error compensation. PLoS One. 12 (5), e0177574 (2017).
- Glanville, J., et al. Deep sequencing in library selection projects: what insight does it bring?. Curr Opin Struct Biol. 33, 146-160 (2015).
- Perelson, A. S., Oster, G. F. Theoretical studies of clonal selection: minimal antibody repertoire size and reliability of self-non-self discrimination. J Theor Biol. 81 (4), 645-670 (1979).
- Miersch, S., et al. Scalable high throughput selection from phage-displayed synthetic antibody libraries. J Vis Exp. (95), e51492 (2015).
- Ponsel, D., Neugebauer, J., Ladetzki-Baehs, K., Tissot, K. High affinity, developability and functional size: the holy grail of combinatorial antibody library generation. Molecules. 16 (5), 3675-3700 (2011).
- Petering, J., McManamny, P., Honeyman, J. Antibody therapeutics – the evolving patent landscape. N Biotechnol. 28 (5), 538-544 (2011).
