सिलवाया विविधता के साथ सिंथेटिक फेज प्रदर्शित फैब पुस्तकालय का निर्माण
Summary
इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक विस्तृत प्रक्रिया के निर्माण के लिए एक फेज-प्रदर्शित सिंथेटिक एंटीबॉडी पुस्तकालय सिलवाया विविधता के साथ । सिंथेटिक एंटीबॉडी बुनियादी अनुसंधान से रोग निदान और चिकित्सकीय के लिए व्यापक अनुप्रयोगों है ।
Abstract
बुनियादी अनुसंधान और चिकित्सा में मोनोक्लोनल एंटीबॉडी (mAbs) की मांग वार्षिक वृद्धि हो रही है । Hybridoma प्रौद्योगिकी १९७५ में अपनी पहली रिपोर्ट के बाद से मॉब विकास के लिए प्रमुख विधि रही है । एक वैकल्पिक प्रौद्योगिकी के रूप में, मॉब विकास के लिए फेज प्रदर्शन तरीकों हुम्रा के बाद से तेजी से आकर्षक हैं, पहली फेज-व्युत्पंन एंटीबॉडी और सबसे बेच mAbs में से एक, २००२ में रुमेटी गठिया के नैदानिक उपचार के लिए अनुमोदित किया गया था । एक गैर पशु आधारित मॉब विकास प्रौद्योगिकी के रूप में, फेज प्रदर्शन प्रतिजन immunogenicity, humanization, और पशुओं के रखरखाव कि पारंपरिक hybridoma प्रौद्योगिकी आधारित एंटीबॉडी विकास से आवश्यक है बाईपास । इस प्रोटोकॉल में, हम 109-1010 एक एकल electroporation के साथ प्राप्य के विचलन के साथ सिंथेटिक फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन । इस प्रोटोकॉल के होते हैं: 1) उच्च दक्षता इलेक्ट्रो-सक्षम सेल तैयारी; 2) uracil की निकासी-युक्त एकल-असहाय डीएनए (dU-ssDNA); 3) Kunkel की विधि आधारित oligonucleotide-निदेशित mutagenesis; 4) electroporation और पुस्तकालय के आकार की गणना; 5) प्रोटीन A/एल आधारित एंजाइम-तह और कार्यात्मक विविधता मूल्यांकन के लिए immunosorbent परख (एलिसा) से जुड़े; और 6) विविधता के डीएनए अनुक्रम विश्लेषण ।
Introduction
mAbs बुनियादी अनुसंधान से रोग निदान और चिकित्सकीय को लेकर व्यापक आवेदन किया है । २०१६ के रूप में, ६० से अधिक mAbs संयुक्त राज्य अमेरिका खाद्य एवं औषधि प्रशासन (USFDA) द्वारा स्व-प्रतिरक्षित रोग, कैंसर, और संक्रामक रोगों के नैदानिक उपचार के लिए1,2अनुमोदित किया गया है ।
१९७५ में, कोल और Milstein एक सेलुलर स्रोत से एक एकल क्लोनिंग के एंटीबॉडी की सतत पीढ़ी के लिए एक तकनीक की सूचना के रूप में संदर्भित करने के लिए ‘ hybridomas ‘ और इस तकनीक बाद में दवा और उद्योग 3 में एक आधारशिला बन गया है ,4. इस विधि द्वारा mAbs के उत्पादन प्रतिजन उत्पादन, माउस प्रतिरक्षण, बी लिम्फोसाइटों के निष्कर्षण, मायलोमा कोशिकाओं के साथ बी कोशिकाओं के फ्यूजन अमर hybridoma कोशिकाओं, क्लोन चयन, और चिकित्सीय अनुप्रयोगों के लिए फार्म के लिए सहित विभिन्न चरणों की आवश्यकता है, humanization मानव विरोधी माउस एंटीबॉडी (हमा)4,5से बचने के लिए आवश्यक है । हालांकि, इस तकनीक के लिए, विषाक्त पदार्थों, रोगजनकों सहित एंटीजन, और अत्यधिक संरक्षित प्रोटीन मॉब उत्पादन5के लिए vivo प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया में एक ट्रिगर में अपेक्षाकृत अप्रभावी हैं ।
१९७८ में, हचिसन एट अल. एक oligonucleotide के उपयोग के लिए एक एकल असहाय भोजी वायरस6में एक अवशेषों के प्रत्यक्ष mutagenesis की सूचना दी । १९८५ में, स्मिथ ने बताया कि विदेशी जीन टुकड़े फ्रेम में जीन एंकोडिंग फेज कोट प्रोटीन III के साथ इनकार किया जा सकता है और इस तरह अपनी infectivity7समझौता किए बिना फेज सतह पर प्रदर्शित किया जा सकता है । इन अग्रणी काम करता है फेज के बाद के निर्माण के लिए एक नींव रखी-प्रतिरक्षा, भोली, और सिंथेटिक रूपों में एकल श्रृंखला चर टुकड़ा (scFv) और प्रतिजन के स्वरूपों के साथ प्रदर्शित एंटीबॉडी पुस्तकालयों-चिकित्सीय के लिए टुकड़ा बाइंडिंग (फैब) मॉब विकास८,९. देखने के तकनीकी बिंदु से, फेज प्रदर्शन आधारित एंटीबॉडी विकास hybridoma-आधारित मॉब विकास के लिए एक पूरक दृष्टिकोण है कि सीमाओं को दरकिनार करने में मदद कर सकते है प्रदान करता है कुछ प्रतिजनों मुद्रा और humanization प्रक्रिया कर सकते है कि hybridoma-व्युत्पंन एंटीबॉडी अक्सर5की आवश्यकता होती है । २०१६ के रूप में, 6 फेज प्रदर्शन-व्युत्पंन mAbs हुम्रा, सबसे सफल रुमेटी गठिया के उपचार के लिए इस्तेमाल mAbs में से एक सहित बाजार में अनुमोदित किया गया है, और कई फेज प्रदर्शन-व्युत्पंन एंटीबॉडी उंमीदवारों के नैदानिक के विभिंन चरणों में वर्तमान में कर रहे है जांच10.
प्रतिरक्षा और भोली फेज एंटीबॉडी पुस्तकालयों के लिए, complementarity की विविधता-प्रकाश और भारी श्रृंखला में क्षेत्रों का निर्धारण (CDRs) प्राकृतिक प्रतिरक्षा प्रदर्शनों की (यानीसे व्युत्पंन है, बी कोशिकाओं से) । इसके विपरीत, सिंथेटिक फेज एंटीबॉडी पुस्तकालयों में CDRs की विविधता पूरी तरह से कृत्रिम है । पुस्तकालय निर्माण के लिए सिंथेटिक दृष्टिकोण एंटीबॉडी संरचना और समारोह11,12के यंत्रवत अध्ययन के लिए अनुक्रम विविधता और पेशकश के अवसरों के डिजाइन पर सटीक नियंत्रण प्रदान करते हैं । इसके अलावा, सिंथेटिक पुस्तकालयों के लिए ढांचे के बहाव, बड़े पैमाने पर औद्योगिक विकास11,12की सुविधा के लिए पुस्तकालय निर्माण से पहले अनुकूलित किया जा सकता है ।
१९८५ में, Kunkel एक-असहाय डीएनए (ssDNA) टेंपलेट-mutagenesis दृष्टिकोण आधारित साइट परिचय-M13 भोजी कुशलता से13में उत्परिवर्तनों का निर्देशन की सूचना दी । इस दृष्टिकोण फेज-प्रदर्शित पुस्तकालयों के निर्माण के लिए बाद में व्यापक रूप से इस्तेमाल किया गया था । फैब CDRs में विविधता लागू करने के लिए डिज़ाइन किए गए रासायनिक संश्लेषित डीएनए oligonucleotides को एक एंटीबॉडी रीढ़ टेम्पलेट के साथ एक phagemid में शामिल किया गया है । इस प्रक्रिया में, phagemid एक uracil-युक्त ssDNA (ड्यू-ssDNA) के रूप में व्यक्त किया जाता है और oligonucleotides annealed डीएनए CDRs और टी-4 डीएनए dsDNA की उपस्थिति में डबल-कतरा डीएनए (T7) को संश्लेषित करने के लिए विस्तारित पर पोलीमरेज़ हैं । अंत में, उत्पंन डी एस-डीएनए electroporation द्वारा ई कोलाई में पेश किया जा सकता है ।
उच्च विविधता, फेज-प्रदर्शित पुस्तकालय निर्माण, इलेक्ट्रो-सक्षम कोशिकाओं के एक दो घटक मिश्रण के उच्च वोल्टेज electroporation और covalently बंद परिपत्र dsDNA (सीसीसी-dsDNA) सावधानी से तैयार किया जाना चाहिए । सिद्धू एट अल. पारंपरिक तरीकों से इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं और डीएनए की तैयारी को संशोधित किया है और बहुत सुधार पुस्तकालय विविधता14.
इस प्रोटोकॉल में, हम 109-1010 एक एकल electroporation के साथ प्राप्य के विचलन के साथ सिंथेटिक फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों के निर्माण के लिए एक विधि का वर्णन । चित्रा 1 सहित पुस्तकालय निर्माण का अवलोकन से पता चलता है: 1) उच्च दक्षता इलेक्ट्रो-सक्षम सेल तैयारी; 2) ड्यूल-ssDNA का निष्कर्षण; 3) Kunkel की विधि आधारित oligonucleotide-निदेशित mutagenesis; 4) electroporation और पुस्तकालय के आकार की गणना; 5) प्रोटीन A/L-तह और कार्यात्मक विविधता मूल्यांकन के लिए एलिसा आधारित; और 6) विविधता के डीएनए अनुक्रम विश्लेषण । सभी एजेंट, उपभेदों और उपकरण सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध हैं । तालिका 1 एजेंट सेटअप दिखाता है ।
Protocol
Representative Results
Discussion
उच्च विविधता, फेज-प्रदर्शित फैब पुस्तकालयों का निर्माण करने के लिए, गुणवत्ता नियंत्रण जांच बिंदुओं के निर्माण की प्रक्रिया के विभिंन चरणों की निगरानी की जरूरत है, इलेक्ट्रो सक्षम कोशिकाओं की क्षमता ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने Kunkel की विधि आधारित सिंथेटिक फैब फेज लाइब्रेरी निर्माण पर महत्वपूर्ण टिप्पणी के लिए सिद्धू लैब से डॉ. Frederic Fellouse की सराहना की । लेखक उच्च दक्षता विद्युत सक्षम ई. कोलाई कोशिकाओं और उच्च गुणवत्ता dU-ssDNA तैयार करने की बहुमूल्य मदद के लिए सिद्धू लैब से श्रीमती Alevtina Pavlenco और अन्य सदस्यों की सराहना करते हैं । इस काम के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित किया गया था चीन (अनुदान सं.: ८१५७२६९८, ३१७७१००६) DW को और ShanghaiTech विश्वविद्यालय द्वारा (अनुदान सं.: F-0301-13-005) एंटीबॉडी इंजीनियरिंग की प्रयोगशाला के लिए ।
Materials
| Reagents | |||
| 1.0 M H3PO4 | Fisher | AC29570 | |
| 1.0 M Tris, pH 8.0 | Invitrogen | 15568-025 | |
| 10 mM ATP | Invitrogen | 18330-019 | |
| 100 mM dithiothreitol | Fisher | BP172 | |
| 100 mM dNTP mix | GE Healthcare | 28-4065-60 | solution containing 25 mM each of dATP, dCTP, dGTP and dTTP. |
| 3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-76-02 | |
| 50X TAE | Invitrogen | 24710030 | |
| Agarose | Fisher | BP160 | |
| Carbenicillin, carb | Sigma | C1389 | 100 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 100 μg/mL. |
| Chloramphenicol, cmp | Sigma | C0378 | 100 mg/mL in ethanol, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| EDTA 0.5 M, pH 8.0 | Invitrogen | AM9620G | |
| Granulated agar | VWR | J637-500G | |
| H2O2 peroxidase substrate | Kirkegaard & Perry Laboratories Inc | 50-65-02 | |
| K2HPO4 | Sigma | 795488 | |
| Kanamycin, kan | Fisher | AC61129 | 50 mg/mL in water, 0.22 μm filter-sterilize, work concentration: 50 μg/mL. |
| KH2PO4 | Sigma | P2222 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 94046 | |
| NaCl | Alfa Aesar | U19C015 | |
| Nanodrop | Fisher | ND2000C | |
| NaOH | Fisher | SS256 | ! CAUTION NaOH causes burns. |
| NON-Fat Powdered Milk | Sangon Biotech | A600669 | |
| PEG-8000 | Fisher | BP233 | |
| Protein A-HRP conjugate | Invitrogen | 101123 | |
| QIAprep Spin M13 Kit | Qiagen | 22704 | |
| QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28706 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | |
| Recombinant Protein L | Fisher | 77679 | |
| T4 DNA polymerase | New England Biolabs | M0203S | |
| T4 polynucleotide kinase | New England Biolabs | M0201S | |
| T7 DNA polymerase | New England Biolabs | M0274S | |
| Tetracycline, tet | Sigma | T7660 | 50 mg/mL in water, 0. 22 μm filter-sterilize, work concentration: 10 μg/mL. |
| Tryptone | Fisher | 0123-07-5 | |
| Tween-20 | Sigma | P2287 | |
| Ultrapure glycerol | Invitrogen | 15514-011 | |
| Uridine | Sigma | U3750 | 25 mg/mL in ethanol, work concentration: 0.25 μg/mL. |
| Yeast extract | VWR | DF0127-08 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Strains | |||
| E.coli CJ236 | New England Biolabs | E4141 | Genotype: dut– ung– thi-1 relA1 spoT1 mcrA/pCJ105(F' camr). Used for preparation of dU-ssDNA. |
| E.coli SS320 | Lucigen | 60512 | Genotype: [F'proAB+lacIq lacZΔM15 Tn10 (tetr)] hsdR mcrB araD139 Δ(araABC-leu)7679 ΔlacX74 galUgalK rpsL thi. Optimized for high-efficiency electroporation and filamentous bacteriophage production. |
| M13KO7 | New England Biolabs | N0315S | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| 0.2-cm gap electroporation cuvette | BTX | ||
| 96-well 2mL Deep-well plates | Fisher | 278743 | |
| 96-well Maxisorp immunoplates | Nunc | 151759 | |
| Baffled flasks | Corning | ||
| Benchtop centrifuge | Eppendorf | 5811000096 | |
| Centrifuge bottles | Nalgene | ||
| ECM-630 electroporator | BTX | ||
| Magnetic stir bars | Nalgene | ||
| Thermo Fisher centrifuge | Fisher | ||
| High speed shaker | TAITEK | MBR-034P | |
| Microplate shaker | QILINBEIER | QB-9002 | |
| Liquid handler for 96 and 384 wells | RAININ | ||
| Mutil-channel pipette | RAININ | E4XLS | |
| Amicon concentrator | Merck | UFC803096 |
Referências
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