Microdissection de segmentos de tecido Renal primária e incorporação com tecnologia de construção romance livre de andaime
Summary
Engenharia de tecido renais construções oferecem uma solução para a escassez de órgãos e os efeitos deletérios da diálise. Aqui, descrevemos um protocolo para micro dissecar murino rins para isolamento dos segmentos córtico-medular. Esses segmentos são implantados livre de andaime celular construções, formando organoids renal.
Abstract
Transplante de rim é agora uma terapia convencional para o estágio final da doença renal. No entanto, com cerca de 96.000 pessoas na lista de espera e apenas um quarto desses pacientes realizar o transplante, há uma grande necessidade de alternativas para aqueles com falência de órgãos. A fim de diminuir as consequências prejudiciais da diálise juntamente com os custos globais de saúde incorre, investigação está em curso em busca de soluções alternativas para a transplantação de órgãos. Implantáveis engenharia de tecido renais celulares construções são uma tal abordagem viável para substituir a funcionalidade renal perdida. Aqui, descrita pela primeira vez, é o microdissection dos rins murino para isolamento de vida córtico segmentos renais. Esses segmentos são capazes de rápida incorporação dentro de construções de andaime-free endotelial-fibroblasto que lhe permitam conexão rápida com a vasculatura hospedeiro uma vez implantada. Os rins do rato adulto foram colhidos em dadores vivos, seguidos pelo estereoscópio microdissection obter segmentos renais 200-300 µm de diâmetro. Várias construções renais foram fabricadas usando segmentos renais primários, colhidos a partir de apenas um rim. Este método demonstra um procedimento que poderia salvar o tecido renal funcional de órgãos que seria caso contrário serão descartados.
Introduction
Doença renal crônica (DRC) é um do atual saúde pública desafios em todo o mundo1. A prevalência de DRC nos Estados Unidos é mais 14% do total da população, com mais de 600.000 americanos sofrem de forma mais severa, estágio final da doença renal (DRT)2. As atuais opções de tratamento disponíveis para aqueles com DRT incluem transplante renal e diálise. Apesar de aproximadamente 25.000 pacientes submetidos a transplante renal a cada ano, um número significativo de pacientes é adicionado anualmente levando a uma grande disparidade entre aqueles que aguardam um órgão de salvamento e aqueles recebendo transplante3. Além de seus graves efeitos negativos na qualidade de vida e longevidade, diálise está associado um encargo financeiro surpreendente. Em 2014, o Medicare paga reivindicações mais totalizou US $ 30 bilhões para DRT pacientes2. Com um suprimento limitado de órgão e sem aparente tendência de baixa em pacientes que necessitam de diálise, os esforços de investigação visam identificar soluções alternativas para diálise e transplante são sempre importantes. Mesmo um atraso relativamente curto na necessidade de diálise aumenta o número de um paciente dos anos de vida ajustados por qualidade e produtividade substancialmente enquanto adiar custos relacionados com a diálise4,5,6.
Soluções para a perda de tecido funcional, assim na DRT, atualmente estão sendo estudadas na engenharia de tecidos e medicina regenerativa laboratórios, com abordagens amplamente variadas, variando de fabricação baseados em andaime organoides para órgão inteiro usando engenharia decellularized estruturas de órgão para implantação celular7,8,9,10,11. Recapitulando complexas estruturas renais de rins marginais ou descartados foi parcialmente investigado. Na verdade, quase 20% dos rins para transplante são descartados por várias razões12,13. O tecido renal funcional destes enxertos putativos poderia ser utilizado e incorporado uma ou muitas construções de engenharia de tecidos. Estudos prévios têm demonstrado a viabilidade de trabalhar com estes órgãos descartados, utilizando os rins para a matriz extra-celular para engenharia de tecido fins14,15. No entanto, poucos têm usado tecido nephronal primário de rins saudáveis para fins de engenharia de tecidos a16,17,18.
Um método anteriormente descrito por Kim et al envolve isolamento de renais “segmentos” de rins de rato saudável, que em seguida foram semeados em andaimes de (PGA) ácidos poliglicólico para fabricação de construção16. No entanto, pouca informação é dada em relação a metodologia exata de dissecação, e segmentos foram obtidos a partir de uma combinação de picagem fina e filtração. Nós descrevemos uma modificação do presente protocolo, que da mesma forma, produz discretos segmentos renais com arquitetura nephronal intacto, mas em vez disso se baseia em técnicas de microdissection. Nephrectomies são executadas em ratos adultos vivos, depois que os rins são transferidos para o microscópio de dissecação onde é removida a cápsula renal, e o tecido é mais dissecado. Pequeno calibre agulhas 30½ G são usadas como instrumentos de corte e também como guias, ajudando na dissecação, como a agulha de diâmetro é igual ao diâmetro do alvo dos segmentos renais. Os segmentos isolados, neste caso murino, renais mantêm viabilidade em cultura e incorporam com construções celular livre de andaime endotelial-fibroblasto19. Essas construções têm sido utilizadas anteriormente para engenheiro de outros órgãos, incluindo pâncreas artificial bio20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Métodos usados para projetar o tecido renal vivo construções variam bastante no que se refere o tipo de células e biomateriais utilizados e em muitos casos, estão desatualizados ou não bem caracterizadas na literatura7. Enquanto muitos estão usando células-tronco abordagens ou sintetizando os componentes individuais da arquitetura renal isoladamente, é a perspectiva de recriar artificialmente um órgão inteiro com mais de 26 tipos diferentes de células diferenciadas de suspensões celul…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH institucional formação pós-doutoral Grant, NIH-HL-007260
Materials
| Non-fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 696 | |
| Fenestrated Sterile Field | Busse Hospital Disposables | 697 | |
| Halsted Mosquito Forceps 5 Curved | Miltex | Mil-7-4 | "Hemostat" in manuscript |
| Extra Fine Graefe Forceps, Curved with teeth | Fine Science Tools | 11155-10 | Fine forceps with teeth |
| Extra Fine Graefe Forceps, Serrated (without teeth) | Fine Science Tools | 11152-10 | Fine forceps without teeth |
| Fine Scissors – Tungsten Carbide | Fine Science Tools | 14568-09 | Iris Scissors |
| Betadine Surgical Scrub with Pump, Povidone-iodine 7.5% | Purdue Products L.P. | 67618-151-17 | |
| Sterile Cotton Gauze Pad (4" x 4") | Fisher Healthcare | 22-415-469 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Solution | Corning | 21-030-CV | |
| Penicillin/Streptomycin Solution, 100X | Corning | 30-002-Cl | |
| Isoflurane, USP | Manufacturer: Piramal, Distributor: McKesson | 2254845 | |
| Nair Hair Remover | Nair | 22600-23307 | Hair Removal Cream in text |
| 200 Proof Ethanol | Decon Laboratories | 2705 | Diluted to 70% Ethanol Solution |
| BioLite 60mm Tissue Culture Dish | Themo-Scientific | 130181 | |
| Press'n Seal | Glad | 12587-70441 | Applied to Stereoscope |
| SZX16 Stereo Microscope | Olympus | SZX16 | |
| Fiber Optic Illuminator | Cole Parmer | 41720-20 | |
| Self-Supporting Dual-Light Pipe, 23" L Gooseneck | Cole Parmer | EW-41720-60 | |
| Scalpel Handle #3 | Miltex | Mil-4-7 | |
| Sterile Rib-Back Carbon Steel Blade, Blade Size 15 | Bard-Parker | 371115 | |
| 31 1/2 Gauge Needle | ThermoFisher Scientific | 14-826F | Becton Dickinson 305106 |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Corning | 10-017-CV | |
| Fetal Select 100% Bovine Serum | Atlas Biologicals | FS-0500-AD | |
| Normal Human Dermal Fibroblasts | Lonza | CC-2511 | |
| Human Adipose Microvascular Endothelial Cells | Sciencell Research Laboratories | 7200 | |
| Surgical Loupes (2.5x) | Orascoptic | (N/A) Custom Order | |
| FGM-2 (Fibroblast Basal Medium with FGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3131, CC-4126 | |
| EGM-2 (Endothelial Basal Medium with EGM-2 SingleQuots Added) | Lonza | CC-3156, CC-4176 | |
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit for Mammalian Cells | ThermoFisher Scientific | L3224 | |
| Anti-Cytokeratin-18 Antibody | Abcam | ab668 | |
| Goat anti-Mouse IgG, Alexa Fluor 633 | ThermoFisher Scientific | A-21052 | |
| Goat anti-Rabbit IgG, Alexa Fluor 546 | ThermoFisher Scientific | A-11010 | |
| Anti-Von Willebrand Factor Antibody | Abcam | ab6994 | |
| Albumin, Fluorescein isothiocyanate Conjugate | Sigma Aldrich | A9771-50MG | |
| Hoescht 33342 | BD Pharmingen | 561908 | |
| Background Buster | Innovex Biosciences | NB306 |
Referências
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