Vi har udviklet en multi godt format polyacrylamid-baseret analyse for sondering effekten af ekstracellulære matrix stivhed på bakteriel infektion af vedhængende celler. Denne analyse er kompatibel med flowcytometri, immunfarvning og trækkraft force mikroskopi, giver mulighed for kvantitative målinger af de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix og sygdomsfremkaldende bakterier.
Ekstracellulær matrix stivhed består en af de flere miljømæssige mekaniske stimuli, der er kendt for at påvirke cellulære adfærd, funktion og skæbne i almindelighed. Selv om stadig flere vedhængende celletyper svar til matrix stivhed er blevet karakteriseret, hvordan tilhænger cellernes følsomhed over for bakteriel infektion afhænger matrix stivhed er stort set ukendt, som er effekten af bakteriel infektion på den biomekanik af værtsceller. Vi hypotesen, at modtagelighed i endothelial værtsceller til en bakteriel infektion afhænger stivhed matrix som disse celler opholde sig, og at infektion af værten celler med bakterier vil ændre deres biomekanik. For at teste disse to hypoteser, blev endotelceller brugt som model værter og Listeria monocytogenes som en model patogen. Ved at udvikle en roman multi godt format assay, viser vi, at effekten af matrix stivhed på infektion i endothelial celler af L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gennem flowcytometri og immunfarvning efterfulgt af mikroskopi. Derudover kan benytter trækkraft force mikroskopi, effekten af L. monocytogenes infektion på vært endotel celle biomekanik blive undersøgt. Den foreslåede metode giver mulighed for analyse af effekten af væv-relevante mekanikere på bakteriel infektion af vedhængende celler, som er et afgørende skridt mod forståelse de biomekaniske interaktion mellem celler, deres ekstracellulære matrix, og sygdomsfremkaldende bakterier. Denne metode er også gældende for en bred vifte af andre typer af undersøgelser på celle biomekanik og svar til substrat stivhed hvor det er vigtigt at være i stand til at udføre mange gentagelser parallelt i hvert forsøg.
Celler i de fleste dyrevæv er typisk vedhængende, både tilstødende celler og deres ekstracellulære matrix (ECM). Forankring af celler til deres ECM er kritiske for mange cellulære processer lige fra celle motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Cellulære anchorage til ECM afhænger både af ECM sammensætning og stivhed. Celler reagerer på ændringer i sidstnævnte af dynamisk re-arrangere deres cytoskeleton, celle-ECM og cell-celle sammenvoksninger, som til gengæld kritisk ændre celle biomekanik og funktioner3,4,5,6 . ECM stivhed kan variere i rummet (dvs., anatomiske placering), tid (dvs., aldring) og patofysiologiske processer (f.eks., åreforkalkning, kræft, infektioner, osv.). For eksempel er det almindeligt accepteret at endothelial celler bosat på stivere-i forhold til blødere-matricer udøve øget styrker deres ECM og hinanden og udviser øget motilitet og spredning7,8. Ligeledes fibroblaster bosat på stivere matricer give høj kontraktile styrker til deres ECM og vise øget spredning, motilitet og ECM produktion9,10,11. Selv om celle mekanik og svar på ECM stivhed er blevet undersøgt udførligt for forskellige celletyper, forholdet mellem vedhængende værtsceller, er stivhed af deres ECM, og bakterielle infektioner stadig stort set ukendt.
For at undersøge rollen for ECM stivhed i bakterier-værtssammenspil celle, blev L. monocytogenes (Lm) valgt som model patogenet. LM er en allestedsnærværende fødevarebårne bakterie, der kan forårsage systemisk infektion i en bred vifte af pattedyr værter. Denne fakultativ intracellulære patogenet kan flytte fra den intestinale epitel til fjerntliggende organer ved gennemkører forskellige typer af vaskulære endothelia. Hvis det krænker blod – hjerne barrieren, Lm kan forårsage meningitis, og når den krydser placenta, kan det medføre spontan abort12,13. LM kan inficere forskellige vært celletyper og kan gøre det ved hjælp af forskellige patogene strategier. LM infektion er blevet undersøgt for det meste i forbindelse med epitelceller, mens langt mindre vides om hvordan Lm kan inficere og bypass endothelial celler foring lumen af blodkar14,15,16. Desuden, det er stadig stort set ukendt, hvordan stivhed af ECM hvor endotelceller bor modulerer LMS evne til at invadere disse værtsceller og derefter sprede. LM og flere ekstra bakteriel arter (dvs., Rickettsia parkeri) drage fordel af actin cytoskelettet af værten celler de inficerer både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle formidling17 , 18 , 19. de opnå dette gennem udtryk af proteiner, der kunne forstyrre vært actin polymerisering veje og producere actin komet haler, at lette deres fremad fremdrift16,20. Som følge af infektion skal cellen vært actin cytoskeleton dynamisk flytte rundt på en måde, der er stadig ikke fuldt karakteriseret, potentielt påvirker biomekanik af værtsceller, herunder de fysiske kræfter de lægge på deres ECM og på hver andre. For at undersøge disse processer, menneskelige mikrovaskulære endotelceller (HMEC-1) blev valgt som model værtsceller af tre grunde: 1. endotelceller er kendt for at være meget mechanosensitive som de konstant er udsat for forskellige fysiske stikord21; 2. strategier Lm beskæftiger for at inficere endotelceller er stadig stort set ukendt22; og 3. HMEC-1 kan er en udødeliggjort cellelinie og, derfor nemt dyrkes og udsat for genmanipulation.
Bakteriel infektion i værtsceller har for det meste været undersøgt in vitro- ved såning celler på glas eller polystyren substrater, der er betydeligt hårdere end de fleste celler12,14,23fysiologiske ECM. At undersøge infektion af celler seedede på en matrix, hvis stivhed er fysiologisk relevante og at belyse rollen af ECM stivhed på infektion af celler af bakterielle patogener, fulgte vi en innovativ tilgang baseret på opdigte tynd microbead-embedded polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed på multi godt plader. Nyhed af den foreslåede tilgang ligger i, at det giver mulighed for overvågning flere betingelser samtidig på grund af dens multi godt format og i, at det er kompatibelt med flere teknikker på grund af den særlige måde, substraterne er bygget. HMEC-1 celler var seedet på disse protein-coated hydrogels og derefter inficeret med forskellige Lm stammer, der enten bliver fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen af ECM stivhed på infektion modtagelighed af vært HMEC-1 celler blev evalueret ved flowcytometri. Derudover immunfarvning og Fluorescens mikroskopi blev brugt til at skelne mellem vedhængende og internaliseret bakterier. Endelig, trækkraft kraft mikroskopi (TFM) blev med held udført for at karakterisere effekten af Lm infektion på trækkraft understreger, at værten endotelceller øve på deres matricer under infektion. Præsenteres analysen kan let modificeret til at give yderligere undersøgelser af virkningen af ECM stivhed på infektion modtagelighed for vedhængende celler ved hjælp af forskellige cellelinjer eller patogener.
Celler kan fornemme en række fysiske miljømæssige stikord, som kan påvirke cellernes morfologi, men også deres gen udtryk og protein aktivitet, hvilket påvirker afgørende celle funktioner og adfærd,45,46. Stivhed af ECM celler er i stigende grad værdsat som et vigtigt modulator af cellulære motilitet, differentiering, spredning og i sidste ende celle skæbne47,48,49. Selv om der har været mange de seneste fremskridt i forståelsen af komplekse biomekaniske interaktion mellem celler og deres ECM, er lidt kendt om hvordan miljømæssige stivhed påvirker modtagelighed af celler til bakteriel infektion. For at lette sådanne undersøgelser, udviklet vi denne nye multi godt analyse baseret på den veletablerede fabrikation af polyacrylamid hydrogels afstemmelige stivhed, som er kompatibel med infektion assays50. Traditionelt, er en bakteriel infektion af celler i vævskultur blevet undersøgt på glas eller polystyren overflader, der er ca 1-3 størrelsesordener stivere end de naturlige ECM mest vedhængende celler8,51. Analysen beskrives her åbner nye motorveje ved at aktivere studiet af bakterier-værtssammenspil i en fysiologisk relevante miljømæssige stivhed regime.
Til bevis for begrebet præsenteres analysen blev HMEC-1 celler valgt som model vedhængende værtsceller og Lm som en model bakteriel patogen. Analysen kan dog forlænges for yderligere undersøgelser, hvis passende modificeret. Sådanne undersøgelser kan omfatte infektion af forskellige pattedyr vedhængende vært celletyper af yderligere patogener, herunder bakterier og vira. For denne særlige assay, gels var protein-coated med kollagen jeg, men afhængigt af værten celletype, er det muligt at bruge en anden ECM protein-belægning, såsom laminin eller fibronektin, at lette udlæg i værtsceller af interesse på hydrogel 52. en yderligere overvejelse, der afhænger af værten celletype er rækken hydrogel stivhed skal undersøges. Rækken af stivhed bør afhænge af hvad er fysiologisk relevante for den specifikke vært celletype og hvor godt at vært lægger danner en éncellelag på en given stivhed hydrogel. Ligeledes, afhængigt af model patogenet ønskede at blive undersøgt, mindre ændringer muligvis skal gennemføres på infektion analysen beskrevet heri.
Innovation af analysen i forhold til tidligere metoder til fremstilling polyacrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unikke funktioner integreret i den foreslåede infektion assay. Først, hydrogels er bygget på flere godt glas bundplade, som gør det muligt for screening af flere betingelser samtidig samt automatisering af visse procedurer. Overvåger flere betingelser på samme tid eller undersøge flere gentagelser er afgørende, da resultatet af en sådan fremgangsmåde kan være påvirket af faktorer såsom vært celle passage og den præcise antal bakterier tilføjet for at inficere værter, som ofte ændre mellem uafhængige forsøg. En ekstra unik funktion af denne analyse er, at hydrogels har en højde på cirka 40 µm, som er tynd nok til at billedet ved hjælp af konventionelle mikroskopi. Vi viste, at vi med succes kan udføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunfarvning efterfulgt af imaging, uden at indføre høje baggrund fluorescens. Endelig, hydrogels er fremstillet af to lag, med den øverste have indlejret fluorescerende microbeads, indespærret i en enkelt fokalplan. Denne attribut sikrer, at der vil være nogen out-of-fokus lys indblanding under imaging. Tilstedeværelsen af perlerne kan både gennemgangen af den overflade topografi af gel til at sikre, at de er ensartede og forbedrer ydeevnen af TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det muligt at beregne de celle-ECM og cell-celle kræfter henholdsvis celler bosat på varierende stivhed matricer. Med denne roman assay, er det muligt at foretage sådanne målinger af fysiske kræfter ved at sammenligne både bidrag af miljømæssige stivhed og infektion samtidigt. Efter en sådan fremgangsmåde har virkning infektion på vært celle mekanik i hele sit løb kan bestemmes. Desuden udviklingen af de intracellulære belastninger af celler kan beregnes ved hjælp af MSM og kan bruges som en foranstaltning af barriere integriteten af éncellelag. Endelig, da multi godt af analysen, det er muligt at samtidig indføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriel infektion, at undersøge mere indgående komplekse samspillet mellem vært celle mekanik og infektion.
En iboende begrænsning af teknikken, der ligger i effekt substrat stivhed kan have om spredning sats af celler. Typisk, i infektion assays, vi skal sikre, at host celle tæthed under forskellige betingelser er de samme. Det er fordi celle tæthed i sig selv kan have en effekt på modtagelighed af værter til infektion. HMEC-1 celler, der blev brugt som værtsceller viser ikke en signifikant forskel i deres antal, når frøet i 24 timer på hydrogels. Dog kan forskellige celletyper udviser differential spredning, afhængigt af hydrogel stivhed, der kan bias infektion undersøgelser. Ligeledes kan infektion bias opstår, når cellerne ikke danne encellelag eller Monter ikke godt på hydrogels, som opstår, når visse celletyper udsås på meget blød matricer (fx, menneskelige navlestrengen endotelceller eller Madin-Darby canine nyre epitelceller seedede på 0,6-kPa hydrogels54,55). Så vidt angår patogener visse bakterier (fx, Borrelia burdgorferi) kan vedhæfte på vært celler og invadere dem men kan også transmigrate gennem dem56. Vi har endnu ikke testet hvis dette assay ville arbejde for patogenet transmigration undersøgelser, men det synes muligt, da tidligere undersøgelser af neutrofiler transmigrating endotelceller seedede på PA hydrogels har dokumenteret for at arbejde med succes57. Der har været masser af undersøgelser viser hvordan man fremstiller polyacrylamid hydrogels af en bestemt Youngs modulus ved at blande de relevante koncentrationer af acrylamid og bis-acrylamid24,25,26 ,27. Især når man ønsker at udføre TFM eksperimenter på celler bosat på hydrogels af varierende stivhed, er det imidlertid afgørende at bekræfte den forventede stivhed af hydrogels enten gennem AFM eller andre indrykning teknikker58. Mindre afvigelser fra den forventede værdi kan opstå på grund af forskellige opløsningsmiddel anvendes eller en stamopløsning, hvis alderen acrylamid, eller af måder AFM målinger er udført (f.eks.figur af AFM tip). Endelig er tilgang præsenteres heri baseret på såning værtsceller på 2D matricer, som eventuelt kan afvige fra en mere realistisk og fysiologisk relevante 3D scenario. Men fremstiller 3D geler med afstemmelige stivhed, såning dem med værtsceller og derefter inficerer dem med patogener, stadig omfatter visse tekniske vanskeligheder. Ikke desto mindre forventer vi, at vi i den nærmeste fremtid vil være stand til at udvide den nuværende assay for at studere infektion i 3D omgivelser.
Sammenfattende beskrevet protokollen sammen med de foreløbige resultater fremlægge bevis at denne roman assay kan blive et ekstremt nyttigt værktøj til at studere infektion af vedhængende værtsceller med patogene bakterier i en kvantitativ mode og meget mere fysiologisk relevante miljø end tidligere undersøgt. Magt opdigte polyacrylamid hydrogels i den foreslåede setup ligger i, at analysen er kompatibel med udførelsen af flere teknikker såsom flowcytometri, immunfarvning efterfulgt af lysmikroskopi og trækkraft kraft mikroskopi. Analysen kan anvendes til undersøgelser der involverer infektion af forskellige vedhængende vært celletyper af patogener, som vi forventer vil have en betydelig indvirkning i både optrævler strategier som patogener inficere værter og lette udviklingen af terapeutiske indgreb mod infektioner.
The authors have nothing to disclose.
Vores tak til M. sidefod, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer af Theriot Lab for deres diskussioner og eksperimentel understøttelse. Dette arbejde blev støttet af NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam Fellowship for Advanced Study (F.E.O.), Stanford Graduate stipendium (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri blev udført på Stanford delt FACS facilitet.
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |