Vi har utviklet en multi godt format polyakrylamid-baserte analysen for utprøvende effekten av ekstracellulær matrix stivhet på bakteriell infeksjon tilhenger celler. Denne analysen er kompatibel med flowcytometri og immunostai-trekkraft force mikroskopi, tillater for kvantitative mål biomekaniske interaksjonene mellom celler, ekstracellulær matrix og patogene bakterier.
Ekstracellulær matrix stivhet består av ett av flere miljømessige mekanisk stimuli som er kjent for å påvirke mobilnettet atferd, funksjon og skjebne generelt. Selv om stadig mer tilhenger celletyper Svar å matrix stivhet har vært preget, hvordan tilhenger cellenes mottakelighet for bakteriell infeksjon er avhengig av matrix stivhet er stort sett ukjent, som er effekten av bakteriell infeksjon på den Biomekanikk av verten cellene. Vi hypothesize at mottakelighet av verten endotelceller til en bakteriell infeksjon, avhenger av stivhet av matrisen som disse cellene bor, og at infeksjon av verten cellene med bakterier vil endre deres biomekanikk. For å teste disse to hypoteser, ble endotelceller brukt som modell verter og Listeria monocytogenes som en modell patogen. Ved å utvikle en roman flere godt format analysen, viser vi at effekten av matrix stivhet på infeksjon av endotelceller av L. monocytogenes kan vurderes kvantitativt gjennom flowcytometri og immunostai-etterfulgt av mikroskopi. I tillegg kan bruker trekkraft force mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infeksjon på verten endothelial celle biomekanikk studeres. Den foreslåtte tillater for analyse av effekten av vev-relevante mekanikere på bakteriell infeksjon av tilhenger celler, som er et viktig skritt mot å forstå biomekaniske samspillet mellom celler, deres ekstracellulær matrix, og patogene bakterier. Denne metoden gjelder også en rekke andre typer studier på cellen biomekanikk og respons på underlaget stivhet hvor det er viktig å kunne utføre mange gjentak parallelt i hvert eksperiment.
Cellene i de fleste dyr vev er vanligvis tilhenger, feste både til nabokommunene cellene og deres ekstracellulær matrix (EFM). Celleområdet til deres ECM er avgjørende for mange mobilnettet prosesser fra cellen motilitet til celle spredning og overlevelse1,2. Mobilnettet anchorage til ECM avhenger både ECM komposisjon og stivhet. Celler reagere på endringer i sistnevnte av dynamisk re-arrangere deres cytoskjelett, celle-ECM og celle-celle adhesjon, som i sin tur kritisk endre cellen biomekanikk og funksjoner3,4,5,6 . ECM stivhet kan variere i rommet (dvs., anatomisk plassering) gang (dvs., aldring) og patofysiologiske prosesser (f.eks, arteriosklerose, kreft, infeksjoner, etc.). For eksempel, det er allment akseptert at endothelial bor på stivere-sammenlignet med mykere-matriser utøve økt styrker deres ECM og hverandre og viser økt motilitet og spredning7,8. Likeledes fibroblaster bosatt på stivere matriser formidle høy kontraktile styrker til deres ECM og Vis økt spredning, motilitet og ECM produksjon9,10,11. Selv om cellen mekanikk og respons på ECM stivhet har vært studert i ulike celletyper, forholdet mellom tilhenger vertsceller, er stivhet ECM og bakterielle infeksjoner fortsatt hovedsakelig ubekjent.
For å studere rollen til ECM stivhet i bakterier-verten celle interaksjoner, ble L. monocytogenes (Lm) valgt som modell patogen. Lm er en allestedsnærværende matbårne bakterie som kan føre til systemisk infeksjon i en rekke pattedyr verter. Denne facultative intracellulær patogen kan flytte fra intestinal epitel å fjerne organer av traversering ulike typer vaskulær endothelia. Hvis det bryter blod – hjerne barrieren, Lm kan forårsake hjernehinnebetennelse, og når den krysser placenta, kan det forårsake spontan abort12,13. Lm kan infisere andre celletyper, og kan gjøre det ved hjelp av forskjellige patogene strategier. Lm infeksjon har vært studert mest i sammenheng med epitelceller, mens vi vet mye mindre om hvordan Lm kan infisere og omkjøringsvei endotelceller fôr lumen blodkar14,15,16. Videre er det fortsatt stort sett ukjent hvordan stivhet av ECM hvor endotelceller bor modulerer Månelandingsfartøyets muligheten til å invadere disse verten cellene og deretter spredt. Lm og flere ekstra bakteriell arter (dvs. Rickettsia parkeri) dra nytte av utgangen cytoskeleton på verten cellene de infisere både invadere i deres cytoplasma og lette celle til celle spredning17 , 18 , 19. de oppnå gjennom uttrykket av proteiner at forstyrre vert begrepsordbok polymerisasjon veier og produsere begrepsordbok kometen hale som letter deres videresende fremdrift16,20. Som følge av infeksjon trenger vert cellenes begrepsordbok cytoskjelett å dynamisk endre på en måte som er fortsatt ikke helt preget, potensielt påvirke biomekanikk du verten cellene de fysiske kreftene de utøve sine ECM og hver andre. For å undersøke disse prosessene, menneskelige mikrovaskulær endotelceller (HMEC-1) ble valgt som modell vertsceller for tre grunner: 1. endotelceller er kjent for å være svært mechanosensitive som de er stadig utsatt for ulike fysiske signaler21; 2. strategier Lm sysselsetter for å infisere endotelceller er fortsatt hovedsakelig ukjent22; og 3. HMEC-1 kan, er en udødeliggjort cellen og derfor lett kultivert og utsatt for genetisk manipulasjon.
Bakteriell infeksjon i verten cellene vært meste studert i vitro av seeding celler i glass eller polystyren underlag som er betydelig stivere enn fysiologiske ECM de fleste celler12,14,23. Undersøke infeksjon av celler seeded på en matrise som stivhet er fysiologisk relevant og belyse rollen ECM stivhet på infeksjon av celler av bakteriell patogener, fulgte vi en innovativ tilnærming basert på fabrikere tynn microbead-innebygd polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet på flere bra plater. Nyheten av den foreslåtte tilnærmingen ligger ved at den tillater overvåking flere vilkår samtidig på grunn av sitt multi vel format og at den er kompatibel med flere teknikker på grunn av bestemt måten substrater er bygget. HMEC-1 celler ble sådd på disse protein-belagt hydrogels og deretter infisert med ulike Lm stammer som blir fluorescerende på internalisering eller er constitutively fluorescerende. Rollen av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet celleområde vert HMEC-1 ble evaluert av flowcytometri. I tillegg immunostai- og fluorescens mikroskopi ble brukt til å skille mellom overholde og internalisert. Til slutt, trekkraft Force mikroskopi (TFM) ble utført betegner effekten av Lm infisert trekkraft stress som verten endotelceller øve på deres matriser under infeksjon. Presentert analysen kan enkelt endres for å aktivere videre studier av effekten av ECM stivhet på infeksjon mottakelighet av tilhenger celler ved hjelp av forskjellige linjer eller patogener.
Cellene kan forstand en rekke fysiske miljømessige signaler, som kan påvirke ikke bare cellenes morfologi, men også deres genet uttrykk og protein aktivitet, noe som påvirker kritiske celle funksjoner og atferd45,46. Stivhet av ECM celler er stadig mer verdsatt som en viktig modulator mobilnettet motilitet, differensiering, spredning, og til slutt cellen skjebne47,48,49. Selv om det har vært mange nylige fremskritt i å forstå komplekse biomekaniske samspillet mellom celler og deres ECM, er lite kjent om hvordan de miljømessige stivheten påvirker mottakelighet av celler til bakteriell infeksjon. For å lette slike studier, utviklet vi denne romanen flere godt analysen basert på veletablerte fabrikasjon av polyakrylamid hydrogels av tunable stivhet som er kompatibel med infeksjon analyser50. Tradisjonelt, har en bakteriell infeksjon i celler i vev kultur vært studert på glass eller polystyren overflater som er ca 1-3 størrelsesordener stivere enn naturlig ECM av mest tilhenger celler8,51. Analysen beskrevet her åpner nye motorveier av muliggjør studiet av bakterier vert interaksjoner i en fysiologisk relevante miljømessige stivhet regime.
Konseptbeviskode til presentert analysen, ble HMEC-1 celler valgt som modell tilhenger vertsceller og Lm som en modell bakteriell patogen. Imidlertid kan analysen forlenges for ytterligere studier hvis hensiktsmessig endret. Slike studier kan innebære infeksjon av ulike pattedyr tilhenger vert celletyper av flere patogener, som bakterier og virus. For denne spesielle analysen, gels ble protein-belagt med kollagen jeg, men avhengig verten celle, er det mulig å bruke en annen ECM protein-belegg, som laminin eller fibronectin, for å forenkle feste verten cellene rundt på hydrogel 52. tas som avhenger verten celle er hydrogel stivhet området studier. Utvalget av stivhet bør avhenge av hva er fysiologisk relevant for den bestemte verten celle og hvor godt den verten festes danner en monolayer til en gitt stivhet hydrogel. Tilsvarende avhengig av modell patogen ønsket undersøkes, må liten modifikasjoner implementeres på infeksjon analysen beskrevet her.
Innovasjonen av analysen i forhold til forrige metoder for produksjon polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i visse unike funksjoner integrert i foreslåtte infeksjon analysen. Først, hydrogels er bygd på flere godt glass bunnplater, som gjør screening av flere vilkår samtidig, samt automatisering av bestemte prosedyrer. Overvåke flere betingelser på samme tid eller undersøke flere gjentak er avgjørende siden utfallet av en slik tilnærming kan påvirkes av faktorer som verten celle passering og hvor mange bakterier lagt til infisere vertene, som ofte endres mellom uavhengige eksperimenter. En unik tilleggsfunksjon for denne analysen er at hydrogels har en høyde på ca 40 µm, som er tynne nok til å bilde ved hjelp av konvensjonelle mikroskopi. Vi viste at vi kan utføre både levende celle mikroskopi og celle fiksering og immunostai-etterfulgt av bildebehandling, uten introdusere høye fluorescens. Til slutt, hydrogels er laget av to lag, med den øvre har innebygd fluorescerende microbeads, i en enkelt fokalplanet. Attributten sikrer at det blir ingen ut-av-fokusere lys konflikt under bildebehandling. Tilstedeværelsen av perlene kan både undersøkelse av overflaten topografien geléer å sikre at de ensartet og forbedrer TFM og MSM24,32,41. Med TFM og MSM er det mulig å beregne celle-ECM og celle-celle styrkene av cellene er bosatt på varierende stivhet matriser. Bruker denne romanen analysen, er det mulig å foreta slike målinger av fysiske krefter ved å sammenligne begge bidrag av miljømessige stivhet og infeksjon samtidig. Etter en slik tilnærming har effekten infeksjonen på verten celle mekanikk gjennom kurs kan bestemmes. Dessuten utviklingen av intracellulær stresset celler kan beregnes ved hjelp av MSM og kan brukes som et mål på barriere integriteten til monolayer. Til slutt er gitt flere godt natur analysen, det mulig å samtidig innføre farmakologiske og genetiske forstyrrelser med en bakteriell infeksjon, å undersøke grundigere det komplekse samspillet mellom verten celle mekanikk og infeksjon.
En iboende begrensning av teknikken ligger i effekt substrat stivhet kan ha på spredningen rate av celler. Vanligvis i infeksjon analyser må vi sikre at verten celle tetthet under ulike forhold er den samme. Det er fordi cellen tetthet av seg selv kan ha en effekt på mottakelighet av verter til infeksjon. HMEC-1 cellene som ble brukt som verten cellene viser ikke en betydelig forskjell i deres tall når seeded 24 h på hydrogels. Imidlertid kan forskjellige celletyper utstilling differensial spredning, avhengig av hydrogel stivhet, som kan lede infeksjon studier. Tilsvarende kan infeksjon skjevhet oppstå når celler utgjør ikke monolayers eller ikke feste på hydrogels, som oppstår når visse celletyper er seeded på myke matriser (f.eks, menneskelige navlestreng endotelceller eller Madin-Darby hjørnetann nyre epitelceller seeding på 0,6-kPa hydrogels54,55). Såvidt patogener er bekymret, visse bakterier (f.eks Borrelia burdgorferi) kan koble til verten cellene og invadere dem, men kan også transmigrate gjennom dem56. Vi har ennå ikke testet Hvis denne analysen vil arbeide for patogen transmigration studier, men det synes mulig siden tidligere studier på nøytrofile transmigrating endotelceller seeded på PA hydrogels er dokumentert for å lykkes57. Det har vært mange studier viser hvordan produksjon polyakrylamid hydrogels av en gitt ung modulus ved å blande de aktuelle konsentrasjonene av akrylamid og bis-akrylamid24,25,26 ,27. Imidlertid, spesielt når man ønsker å utføre TFM eksperimenter på bor på hydrogels av varierende stivhet, er det viktig å bekrefte forventede stivhet av hydrogels enten gjennom AFM eller andre innrykk teknikker58. Avvik fra forventet verdi kan forekomme et annet løsemiddel brukes eller en alderen akrylamid lager løsning, eller måtene AFM målinger er utført (f.eksform av AFM spissen). Til slutt er tilnærmingen som presenteres her basert på seeding verten cellene i 2D matriser, som kan variere fra en mer realistisk og fysiologisk relevante 3D. Men omfatter produksjon 3D gels med tunable stivhet, såing dem med verten cellene og deretter infiserer dem med patogener, fortsatt visse tekniske problemer. Likevel forventer vi at i nær framtid vi vil være i stand til å utvide gjeldende analysen for å studere infeksjon i 3D omgivelser.
For å oppsummere, beskrevet protokollen sammen med de foreløpige resultatene gir bevis for at denne romanen analysen kan bli et svært nyttig verktøy for å studere infeksjon tilhenger vert celler med patogene bakterier i en kvantitativ mote og mye mer fysiologisk relevante miljøet enn tidligere undersøkt. Kraften i fabrikere polyakrylamid hydrogels i foreslåtte oppsettet ligger i at analysen er kompatibel med resultatene av flere teknikker som flowcytometri, immunostai-etterfulgt av * lys, og trekkraft tvinge mikroskopi. Analysen kan brukes for studier som involverer infeksjon av annen tilhenger vert celletyper av patogener, som vi forventer vil ha en betydelig innvirkning både unraveling strategier som patogener infisere verter og tilrettelegge for utvikling av terapeutiske tiltak mot infeksjoner.
The authors have nothing to disclose.
Vår takk til M. bunntekst, R. Lamason, M. Rengaranjan og medlemmer av det Theriot for diskusjoner og eksperimentell støtte. Dette arbeidet ble støttet av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam fellesskap for avanserte studier (F.E.O.), Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) og American Heart Association (E.E.B.). Flowcytometri ble utført ved Stanford deles FACS anlegget.
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |