Vi har utvecklat en flera format polyakrylamid-baserad analys för avsökning av effekten av extracellulärmatrix stelhet på bakteriell infektion av vidhäftande celler. Denna analys är kompatibel med flödescytometri, immunfärgning och dragkraft kraft mikroskopi, möjliggör kvantitativa mätningar av biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris och patogena bakterier.
Extracellulär matrix stelhet består av en av de flera mekaniska stimuli från omgivningen som är kända att påverka cellulära beteende, funktion och öde i allmänhet. Även om allt mer vidhäftande celltyper Svaren till matrix stelhet har karaktäriserats, hur cellernas känslighet för bakteriell infektion beror på matrix stelhet är till stor del okända, som är effekten av bakteriell infektion på den biomekanik av värdceller. Vi hypotes att mottagligheten för värd endothelial celler till en bakteriell infektion beror på styvheten i matrisen där dessa celler finns, och att infektionen värdens celler med bakterier kommer att förändra deras biomekanik. För att testa dessa två hypoteser, användes endotelceller som modell värdar och Listeria monocytogenes som en modell patogen. Genom att utveckla en roman flera format assay, visar vi att effekten av matrix stelhet på infektion av endothelial celler av L. monocytogenes kan bedömas kvantitativt genom flödescytometri och immunfärgning följt av mikroskopi. Dessutom kan använder dragkraft kraft mikroskopi, effekten av L. monocytogenes infektion på värd endotelceller biomekanik studeras. Den föreslagna metoden möjliggör analys av effekten av vävnad-relevanta mekanik på bakteriell infektion av vidhäftande celler, som är ett viktigt steg mot att förstå de biomekaniska interaktioner mellan celler, deras extracellular matris, och patogena bakterier. Denna metod är också tillämplig på en mängd andra typer av studier på cell biomekanik och svar på substrat stelhet där det är viktigt för att kunna utföra många replikat parallellt i varje experiment.
Celler i mest djurvävnader är vanligtvis vidhäftande, bifoga både till angränsande celler och deras extracellulär matrix (ECM). Ankringen av celler till sin ECM är avgörande för många cellulära processer som sträcker sig från cell motilitet till cell spridning och överlevnad1,2. Cellulära förankringar till ECM beror både på ECM sammansättning och stelhet. Cellerna reagera på förändringar i den senare av dynamiskt omarrangera sin cytoskelettet, cell-ECM och cell-cell sammanväxningar, vilka i sin tur kritiskt förändrar cell biomekanik och funktioner3,4,5,6 . ECM stelhet kan variera i rymden (dvs, anatomiska läge), i tid (dvs, åldrande) och patofysiologiska processer (t.ex., åderförkalkning, cancer, infektioner, etc.). Exempelvis är det allmänt accepterat att endothelial celler bosatt på styvare-jämfört med mjukare-matriser utöva ökade krafter till sin ECM och till varandra och uppvisar ökad motilitet och spridning7,8. Jämväl, fibroblaster bosatta på styvare matriser förmedla hög kontraktila krafter till sin ECM och Visa ökad spridning, motilitet och ECM produktion9,10,11. Även om cellen mekanik och svar på ECM stelhet har studerats ingående för olika celltyper, förhållandet mellan vidhäftande värdceller, är styvheten i sin ECM, och bakteriella infektioner fortfarande till stor del okända.
För att studera rollen av ECM stelhet i bakterier-värd-cell interaktioner, valdes L. monocytogenes (Lm) som patogenen som modell. LM är en allestädes närvarande livsmedelsburna bakterie som kan orsaka systemisk infektion i en mängd olika däggdjur värdar. Detta fakultativt intracellulära patogener kan flytta från intestinala epitelet till avlägsna organ genom att gå igenom olika typer av vaskulär endothelia. Om det bryter mot den blood – brain barriären, Lm kan orsaka hjärnhinneinflammation, och när den passerar moderkakan, kan det orsaka spontan abort12,13. LM kan infektera annan värd celltyper och kan göra det genom att använda olika patogena strategier. LM-infektion har undersökts främst i samband med epitelceller, medan mycket mindre är känt om hur Lm kan infektera och bypass endothelial celler som kantar lumen blodkärl14,15,16. Dessutom är det fortfarande till stor del okänt hur styvheten i ECM där endotelceller bosatta modulerar Lm: s förmåga att invadera dessa värdceller och sedan sprida. LM och flera ytterligare bakteriearter (dvs, Rickettsia parkeri) dra nytta av aktin cytoskelettet värdens celler de infektera både invadera i cytoplasman och underlätta cell till cell spridning17 , 18 , 19. de uppnå detta genom uttrycket av proteiner som möjligt för dem att störa värd aktin polymerisation vägar och att producera aktin komet svansar som underlättar deras framåt framdrivning16,20. Till följd av infektion behöver värdcellens aktin cytoskelettet dynamiskt ordna på ett sätt som är fortfarande inte helt kännetecknas, som potentiellt påverkar biomekanik av vara värdcellerna inklusive de fysiska krafterna som de utövar på sin ECM och på varje andra. För att undersöka dessa processer, mänskliga mikrovaskulära endotelceller (HMEC-1) valdes som modell värdceller av tre skäl: 1. endotelceller är kända för att vara mycket mechanosensitive som de utsätts ständigt för olika fysiska ledtrådar21; 2. de strategier som Lm sysselsätter för att infektera endotelceller är fortfarande till stor del okända22; och 3. HMEC-1 kan är en förevigade cellinje och, därför, lätt odlade och utsatts för genetisk manipulation.
Bakteriell infektion i värdceller har mestadels varit studerade in vitro- genom sådd celler på glas eller polystyren substrat som är betydligt styvare än fysiologiska ECM av de flesta celler12,14,23. Att undersöka infektionen av celler som dirigeras till en matris vars stelhet är fysiologiskt relevanta och att klargöra rollen av ECM stelhet på infektionen av celler av bakteriella patogener, följde vi en nyskapande strategi baserad på tillverka tunna microbead-embedded polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet på plattor med flera. Nya i det föreslagna tillvägagångssättet ligger i att det tillåter övervakning flera villkor samtidigt på grund av dess flera format och att den är kompatibel med flera tekniker beroende på det särskilda sätt som substratesna byggs. HMEC-1 celler seedade på dessa protein-belagd hydrogels och sedan infekterade med olika Lm stammar som antingen blir fluorescerande vid internalisering eller är konstitutivt fluorescerande. Rollen av ECM stelhet på infektion känslighet av HMEC-1 värdceller utvärderades av flödescytometri. Dessutom användes immunfärgning och fluorescence mikroskopi för att skilja mellan vidhängande och internaliserad bakterier. Slutligen utfördes framgångsrikt dragkraft Force Microscopy (TFM) för att karakterisera effekten av Lm infektion på dragkraft betonar att värd endotelceller utövar på deras matriser under infektion. Presenterade analysen kan enkelt ändras för att möjliggöra ytterligare studier på effekten av ECM stelhet på infektion känslighet av vidhäftande celler med olika cellinjer eller patogener.
Celler kan känna en mängd fysiska miljö ledtrådar, vilket kan påverka inte bara cellernas morfologi men också deras gen uttryck och protein aktivitet, vilket påverkar kritiska cell funktioner och beteenden45,46. Styvheten i ECM av celler uppskattas alltmer som en viktig modulator av cellulära motilitet, differentiering, spridning, och slutligen cell öde47,48,49. Även om det har förekommit många senaste framsteg i att förstå det komplexa biomekaniska samspelet mellan celler och deras ECM, är lite känt om hur miljön stelhet påverkar mottagligheten av celler för bakteriell infektion. För att underlätta sådana studier har utvecklat vi denna roman flera analys baserat på väletablerade tillverkning av polyakrylamid hydrogels avstämbara styvhet som är förenlig med infektion analyser50. Traditionellt har har en bakteriell infektion i celler i vävnadskultur studerats på glas eller polystyren ytor som är cirka 1-3 storleksordningar styvare än naturliga ECM mest vidhäftande celler8,51. Analysen beskrivs här öppnar nya vägar genom att aktivera studiet av bakterier-värd-interaktioner i en fysiologiskt relevanta miljömässiga stelhet regim.
För bevis på konceptet presenteras analysens valdes HMEC-1 celler som modell vidhäftande värdceller och Lm som modell bakteriella patogener. Analysen kan dock förlängas för ytterligare studier om lämpligt ändras. Sådana studier kan innebära infektion av olika däggdjur vidhäftande värd celltyper genom ytterligare patogener, inklusive bakterier och virus. För denna särskilda analys, geler protein-belades med kollagen I, men beroende på mottagande cell, är det möjligt att använda en annan ECM protein-beläggning, såsom laminin eller Fibronektin, att underlätta fastsättningen av vara värdcellerna sevärdheter på hydrogel 52. en ytterligare faktor som beror på vilken värd cell är intervallet hydrogel stelhet studeras. Spänna av stelhet bör bero på vad är fysiologiskt relevanta för den specifika värd celltypen och hur väl den värden fäster bildar en enskiktslager på en viss stelhet hydrogel. På samma sätt, beroende på modell patogener önskas att undersökas, smärre ändringar behöva genomföras på infektion analysen beskrivs häri.
Innovation av analysen jämfört med tidigare metoder för tillverkning polyakrylamid hydrogels24,50,53 ligger i vissa unika funktioner integrerade i föreslagna infektion analysen. Först, hydrogels byggs på flera glas botten pläterar, som möjliggör screening av flera villkor samtidigt samt automatisering av vissa förfaranden. Övervaka flera villkor på samma gång eller undersöka flera replikat är avgörande eftersom resultatet av en sådan strategi kan påverkas av faktorer som den mottagande cell passagen och det exakta antalet bakterier tillsätts infektera värdar, som ofta ändrar mellan oberoende experiment. En ytterligare unik funktion av denna analys är att hydrogeler har en höjd av cirka 40 µm, vilket är tunn nog att bilden med hjälp av konventionella mikroskopi. Vi visade att vi framgångsrikt kan utföra både levande cell mikroskopi cell fixering och immunfärgning följt av imaging, utan att införa hög bakgrund fluorescens. Slutligen är hydrogeler tillverkade av två lager, med den övre med inbäddade fluorescerande mikrokulor, begränsade till en enda fokalplan. Detta attribut säkerställer att det inte blir någon out-of-fokus ljus stör under imaging. Förekomsten av pärlorna gör prövning såväl av ytans topografi av gelerna så att de är enhetliga och förbättrar prestanda för TFM och MSM24,32,41. Med TFM och MSM är det möjligt att beräkna cell-ECM och cell-cell styrkor respektive celler bosatt på varierande stelhet matriser. Med denna roman analys, är det möjligt att göra sådana mätningar av fysiska krafter genom att jämföra båda bidrag av miljömässiga stelhet och infektion samtidigt. Efter ett sådant tillvägagångssätt har effekt infektionen på värdcellen mekanik under hela dess kurs kan bestämmas. Dessutom utvecklingen av intracellulära stressen i celler kan beräknas med hjälp av MSM och kan användas som ett mått på enskiktslager barriär integritet. Slutligen, flera med tanke på analysen, det är möjligt att samtidigt införa farmakologiska och genetiska störningar med en bakteriell infektion, att undersöka mer ingående det komplexa samspelet mellan mottagande cell mekanik och infektion.
En inneboende begränsning i tekniken ligger i effekt substrat styvheten kan ha på andelen spridning av celler. Vanligtvis i infektion analyser måste vi se till att mottagande cell densiteten under olika förhållanden är samma. Det beror på att cell densiteten av sig själv kan påverka känsligheten för värdar till infektion. HMEC-1 celler som användes som värdceller visar inte en signifikant skillnad i antalet när seedade för 24 h på hydrogels. Dock kan olika celltyper uppvisar differentiell spridning, beroende på hydrogel styvheten, som kan bias infektion studier. Likaså kan infektion bias uppstå när celler utgör inte enskiktslager eller inte fäster bra på hydrogels, som uppstår när vissa celltyper är seedade på mycket mjuk matriser (t.ex., mänskliga navelsträngen endotelceller eller Madin-Darby canine njure epitelceller ympats på 0,6-kPa hydrogels54,55). Vad beträffar patogener är, vissa bakterier (t.ex., Borrelia burdgorferi) kan fästa värd celler och invaderar dem men kan också transmigrate genom dem56. Vi har inte ännu testat om denna analys skulle fungera för patogen själavandring studier, men det verkar möjligt eftersom tidigare studier på neutrofiler transmigrating endothelial celler seedade på PA hydrogeler har dokumenterats för att arbeta framgångsrikt57. Det har varit en hel del studier visar hur man tillverkar polyakrylamid hydrogeler av en given Youngs modul genom att blanda lämpliga koncentrationerna av akrylamid och bis-akrylamid24,25,26 ,27. Det är dock särskilt när man önskar utföra TFM experiment på celler som bor på hydrogels varierande styvhet, kritiska att bekräfta förväntade styvheten i hydrogels antingen via AFM eller andra indrag tekniker58. Små avvikelser från det förväntade värdet kan uppstå på grund av olika lösningsmedel används eller en år akrylamid stamlösning, eller på sätt AFM är mätningar utförs (t.ex., formen på AFM spets). Slutligen är den strategi som presenteras häri baserad på sådd värdceller på 2D matriser, som kan skilja sig från en mer realistisk och fysiologiskt relevanta 3D scenario. Tillverkning 3D geler med avstämbara stelhet, omfattar sådd dem med värdceller och sedan smittar dem med patogener, fortfarande emellertid vissa tekniska svårigheter. Ändå, vi räknar med att inom en snar framtid kommer vi att kunna utöka den aktuella analysen för att studera infektion i en 3D miljö.
Sammanfattningsvis beskrivs protokollet tillsammans med de preliminära resultaten bevisa att denna roman analys kan bli ett mycket användbart verktyg för att studera infektion av vidhäftande värdceller med patogena bakterier på ett kvantitativt sätt och i en mycket mer fysiologiskt relevant miljö än tidigare undersökta. Kraften i fabricera polyakrylamid hydrogels i föreslagna setup ligger i att analysen är kompatibel med utförandet av flera tekniker såsom flödescytometri, immunfärgning följt av ljusmikroskopi och dragkraft tvinga mikroskopi. Analysen kan användas för studier med infektion av annan vidhäftande värd celltyper av patogener, som vi räknar med kommer att ha en betydande inverkan på både nysta upp strategier som patogener infektera värdar och underlätta utvecklingen av Terapeutiska interventioner mot infektioner.
The authors have nothing to disclose.
Vårt tack till M. sidfot, R. Lamason, M. Rengaranjan och medlemmar av Theriot Lab för deras diskussioner och experimentellt stöd. Detta arbete stöds av NIH R01AI036929 (J.A.T.), HHMI (J.A.T.), HHMI Gilliam stipendiet för avancerad studie (F.E.O.), den Stanford Graduate Fellowship (F.E.O.) och den amerikanska hjärtat Association (E.E.B.). Flödescytometri utfördes vid Stanford delade FACS anläggningen.
Reagents | |||
Sodium hydroxide pellets | Fisher | S318-500 | |
(3-Aminopropyl)triethoxysilane | Sigma | A3648 | |
25% gluteraldehyde | Sigma | G6257-100ML | |
40% Acrylamide | Sigma | A4058-100ML | |
Bis-acrylamide solution (2%w/v) | Fisher Scientific | BP1404-250 | |
Fluorospheres carboxylate-modified microspheres, 0.1 μm, yellow-green fluorescent (505/515) | Invitrogen | F8803 | |
Ammonium Persulfate | Fisher | BP17925 | |
TEMED | Sigma | T9281-25ML | |
Sulfo-SANPAH | Proteochem | c1111-100mg | |
Collagen, Type I Solution from rat | Sigma | C3867-1VL | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | J.T. Baker | 9224-01 | |
HEPES, Free acid | J.T. Baker | 4018-04 | |
Leibovitz's L-15 medium, no phenol red | Thermofischer | 21083027 | |
MCDB 131 Medium, no glutamine | Life technologies | 10372019 | |
Foundation Fetal Bovine Serum, Lot: A37C48A | Gemini Bio-Prod | 900108 500ml | |
Epidermal Growth Factor, EGF | Sigma | E9644 | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888 | |
L-Glutamine 200mM | Fisher | SH3003401 | |
DPBS 1X | Fisher | SH30028FS | |
Gentamicin sulfate | MP biomedicals | 194530 | |
Cloramphenicol | Sigma | C0378-5G | |
DifcoTM Agar, Granulated | BD | 214530 | |
BBL TM Brain-heart infusion | BD | 211059 | |
Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate – 10 mg/ul solution in water | Invitrogen | H3570 | |
Formaldehyde 16% EM grade | Electron microscopy | 15710-S | |
Anti-Listeria monocytogenes antibody | Abcam | ab35132 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor® 546 conjugate | Thermofischer | A-11035 | |
0.25% trypsin-EDTA , phenol red | Thermofischer | 25200056 | |
COLLAGENASE FROM CLOSTRIDIUM HISTOLYTIC | Sigma | C8051 | |
Streptomycin sulfate | Fisher Scientific | 3810-74-0 | |
Sucrose | Calbiochem | 8510 | |
Sodium dodecyl sulfate | Thermofischer | 28364 | |
MES powder | Sigma | M3885 | |
KCl | J.T. Baker | 3040-05 | |
MgCl2 | J.T. Baker | 2444-1 | |
EGTA | Acros | 40991 | |
Disposable lab equipment | |||
12 mm circular glass coverslips | Fisherbrand | 12-545-81 | No. 1.5 Coverslip | 10 mm Glass Diameter | Uncoated |
Glass bottom 24 well plates | Mattek | P24G-1.5-13-F | |
5 ml polystyrene tubes with a 35 μm cell strainer cap | Falcon | 352235 | |
T-25 flasks | Falcon | 353118 | |
50 ml conical tubes | Falcon | 352070 | |
15 ml conicals tubes | Falcon | 352196 | |
Disposable Serological Pipettes (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, 25 ml) | Falcon | 357551 | |
Pasteur Glass Pipettes | VWR | 14672-380 | |
Pipette Tips (1-200 μl, 101-1000 μl) | Denville | P1122, P1126 | |
Powder Free Examination Gloves | Microflex | XC-310 | |
Cuvettes bacteria | Sarstedt | 67.746 | |
Razors | VWR | 55411-050 | |
Syringe needle | BD | 305167 | |
0.2um sterilizng bottles | Thermo Scientific | 566-0020 | |
20 ml syringes | BD | 302830 | |
0.2um filters | Thermo Scientific | 723-2520 | |
wooden sticks | Grainger | 42181501 | |
Saran wrap | Santa Cruz Biotechnologies | sc-3687 | |
Plates bacteria | Falcon | 351029 | |
Large/non-disposable lab equipment | |||
Tissue Culture Hood | Baker | SG504 | |
Hemacytometer | Sigma | Z359629 | |
Bacteria incubator | Thermo Scientific | IGS180 | |
Tissue culture Incubator | NuAire | NU-8700 | |
Vacuum chamber/degasser | Belart | 42025 | 37˚C and 5% CO2 |
Inverted Nikon Diaphot 200 epifluorescence microscope | Nikon | NIKON-DIAPHOT-200 | |
Cage Incubator | Haison | Custom | |
Scanford FACScan analyzer | Stanford and Cytek upgraded FACScan | Custom | |
Pipette Aid | Drummond | 4-000-110 | |
Pipettors (10 μl, 200 μl, 1000ul) | Gilson | F144802, F123601, F123602 | |
pH meter | Mettler Toledo | 30019028 | |
forceps | FST | 11000-12 | |
1 L flask | Fisherbrand | FB5011000 | |
Autoclave machine | Amsco | 3021 | |
Stir magnet plate | Bellco | 7760-06000 | |
Magnet stirring bars | Bellco | 1975-00100 | |
Spectrophotometer | Beckman | DU 640 | |
Scanford FACScan analyzer | Cytek Biosciences | Custom Stanford and Cytek upgraded FACScan | |
Software | |||
Microscope Software (μManager) | Open Imaging | ||
Matlab | Matlab Inc | ||
Flowjo | FlowJo, LLC | ||
Automated image analysis software, CellC | https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ | The software is freely available. Eexecutable files and MATLAB source codes can be obtained at https://sites.google.com/site/cellcsoftware/ |