O isolamento e a cultura de células primárias de Epicárdica derivado de espécimes de coração adulto e Fetal humano

Resumo

O epicárdio desempenha um papel crucial no desenvolvimento e na reparação do coração, fornecendo células e fatores de crescimento da parede miocárdica. Aqui, descrevemos um método de cultura primária Epicárdica células de origem humana que permite o estudo e a comparação de suas características de adultas e de desenvolvimento.

Resumo

O epicárdio, uma camada de células epiteliais, cobrindo o miocárdio, tem um papel essencial durante o desenvolvimento cardíaco, bem como na resposta de reparação do coração após lesão isquêmica. Quando ativado, Epicárdica células passam por um processo conhecido como epiteliais de transição mesenquimal (EMT) para fornecer células para a regeneração do miocárdio. Além disso, o epicárdio contribui através da secreção de fatores essenciais parácrina. Para apreciar plenamente o potencial regenerativo do epicárdio, um modelo de célula humana é necessário. Aqui podemos delinear um modelo de cultura celular novela para derivar células derivadas Epicárdica primárias (EPDCs) de tecido cardíaco humano adulto e fetal. Para isolar EPDCs, o epicárdio é dissecado do lado de fora do espécime coração e transformado em uma suspensão de célula única. Em seguida, EPDCs são chapeados e cultivadas em meio de EPDC contendo o inibidor da 5-quinase ALK SB431542 para manter seu fenótipo epitelial. EMT é induzida pela estimulação com TGFβ. Este método permite, pela primeira vez, o estudo do processo de EMT Epicárdica humana em um ambiente controlado e facilita a ganhar mais conhecimento no secretome de EPDCs que pode ajudar na regeneração do coração. Além disso, esta abordagem uniforme permite a comparação direta do comportamento humano adulto e fetal Epicárdica.

Introdução

O epicárdio, uma camada epitelial de célula única que envelopes o coração, é de vital importância para o desenvolvimento cardíaco e reparação (revisto em Smits et al ¹). desenvolvente, epicárdio surge a partir do órgão de proepicardial, uma pequena estrutura localizada na base do coração em desenvolvimento. Em torno do desenvolvimento dia E9.5 no rato e 4 semanas pós-concepção em humanos, células começam a migrar a partir desta estrutura de couve-flor e cubra o desenvolvimento do miocárdio². Uma vez que é formada uma camada única de células epiteliais, uma parte das células Epicárdica sofre epitelial de transiçã....

Protocolo

Todos os experimentos com amostras de tecido humano foram aprovados pelo Comitê de ética do centro médico da Universidade de Leiden e está em conformidade com a declaração de Helsinque. Todas as etapas são executadas com equipamentos esterilizados em um fluxo de cultura de células do armário.

1. preparações

1. Prepare o suporte de EPDC pela mistura de Dulbecco médio da águia modificado (DMEM baixa-glicose) e meio 199 (M199) em uma proporção de 1:1. Adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS, calor inativado por 25 min a 56 ° C) e completar com 100 U/mL penicilina e estreptomicina 100 mg/mL. Pré-aquecer o meio....

Resultados

Aqui, nós esboçamos um protocolo simples para isolar EPDCs de humano adulto e fetal tecido cardíaco (Figura 1). Este protocolo tira proveito da localização facilmente acessível do epicárdio do lado de fora do coração (figura 1A). Coloração da orelha coração após dissecação demonstra que o epicárdio WT1 + é removido enquanto o subjacente subepicardial da matriz extracelular e o tecido do miocárdio permanecem intactas (

Discussão

Aqui descrevemos um protocolo detalhado para isolar e cultura primárias Epicárdica células derivadas de corações humanos adultas e fetais. Extensa caracterização dessas células tem sido publicado anteriormente¹⁷. Mostramos que os dois tipos de células podem ser mantidos como células epiteliais de paralelepípedos, como quando cultivadas com o inibidor de quinase ALK5 SB431542. EMT é parte integrante da ativação epicárdico na vivo durante o desenvolvimento e a resposta pós-lesão. EMT pode s.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Dulbecco' s Águia modificada' s medium + GlutaMAX	Gibco	21885-025
Medium 199	Soro Fetal Bovino Gibco	31150-022
	Gibco	10270-106
Tripsina 0,25%	Invitrogen	25200-056
Penicilina G sal de sódio	Roth	HP48
Sulfato de estreptomicina	Roth	HP66
Tripsina 1:250 de pâncreas bovino	Serva	37289
EDTA	Sigma	E4884
Gelatina de pele suína	Placas de cultura Sigma-Aldrich	G1890
6 poços	Greiner bio-one	657160
Placas de cultura 12 poços	Corning	3512
Placas de cultura 24 poços	Greiner bio-one	662160
SB 431542	Tocris	1614
Dimetil Sulfóxido (DMSO)	Merck	102931
100-1000µ L Pontas de pipeta filtradas	Corning	4809
Pipeta de 10 ml	Greiner bio-one	607180
Pipeta de 5 ml	Greiner bio-one	606180
Placa de cultura de células 100/20 mm	Greiner bio-one	664160
PBS	Gibco	10010056	caseiros e esterilizados
1,5 mL	Eppendorf
Tubos de centrífuga de 15 ml	Greiner bio-one	188271
Tubos de centrífuga de 50 ml	Greiner bio-one	227261
Seringa de 10 mL	305959		Becton Dickinson
Calibre 19 Agulhas	Becton Dickinson	301700
Calibre 21 Becton	Dickinson	304432
Peneiras de Células EASYstrainer, 100 µ m	Greiner bio-one	542000
TGFβ 3	R& D systems	243-B3
Anti-Actina Monoclonal, &alfa;-Músculo Liso	Sigma	A2547
Anti-Mouse Alexa Fluor 555	Invitrogen	A31570
Alexa Fluor 488 Faloidina	Invitrogen	A12379
Equipamento
Nome	Empresa	Número de Catálogo	Comentários
Pipeta P1.000	Gilson	F123602
Controlador de pipeta	Integra	155 015
Estereomicroscópio	Leica	M80
Microscópio de Luz Invertida	Olympus	CK2
Centrífuga	Eppendorf	5702
Banho-maria	GFL	1083

Ou tubos Eppendorf 0030120086 Agulhas