De isolatie en de cultuur van de primaire Epicardial cellen, afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart Specimens
Summary
De Epicard speelt een cruciale rol in de ontwikkeling en het herstel van het hart door het verstrekken van cellen en de groei factoren op de myocardiale wand. Hier beschrijven we een methode om cultuur menselijke primaire epicardial cellen, die het mogelijk de studie en vergelijking van de kenmerken van hun ontwikkelings- en volwassen maakt.
Abstract
De Epicard, een epitheliale cellaag die betrekking hebben op het myocardium, heeft een essentiële rol tijdens de ontwikkeling van de cardiale, alsmede in het antwoord van de reparatie van het hart na ischemische schade. Wanneer geactiveerd, ondergaan epicardial cellen een proces dat bekend staat als epitheliale mesenchymale overgang (EMT) om cellen aan de regeneratie myocard. Bovendien draagt de Epicard via secretie van essentiële paracrine factoren. Om ten volle waarderen de regeneratieve potentieel van de Epicard, is een menselijke cel model vereist. Hier duidelijk naar voren komt een nieuwe cel cultuur model voor het primaire epicardial afgeleide cellen (EPDCs) ontlenen menselijke volwassen en foetale cardiale weefsel. Isoleren EPDCs, is de Epicard ontleed aan de buitenkant van het hart model en verwerkt tot een enkele celsuspensie. Vervolgens zijn EPDCs verzinkt en gekweekt in EPDC medium met de ALK 5-kinase inhibitor SB431542 om hun epitheliale fenotype. EMT wordt geïnduceerd door stimulatie met TGFβ. Deze methode activeert, voor de eerste keer, de studie van het proces van menselijke epicardial EMT in een gecontroleerde omgeving, en vergemakkelijkt meer inzicht verwerven in de secretome van EPDCs die kan steun hart regeneratie. Bovendien voorziet deze uniforme aanpak in directe vergelijking van menselijke volwassen en foetale epicardial gedrag.
Introduction
De Epicard, een eencellige epitheliale laag dat enveloppen het hart, is van vitaal belang voor de ontwikkeling van de cardiale en reparatie (herzien in Smits et al. 1). ontwikkelingsachterstand, de Epicard vloeit voort uit de proepicardial-orgel, een kleine structuur gelegen aan de voet van het ontwikkelende hart. Rond ontwikkelings dag E9.5 in muis en 4 weken na conceptie in mens beginnen cellen om te migreren van deze structuur van bloemkool en dekken de ontwikkelende myocard-2. Zodra een eencellige epitheliale laag wordt gevormd, ondergaat een deel van de epicardial cellen epitheliale mesenchymale overgang (EMT). Tijdens de EMT, cellen verliezen hun epitheliale kenmerken, zoals de cel verklevingen, en krijgen een mesenchymale fenotype die geeft hen de capaciteit om te migreren naar de ontwikkelingslanden myocard. De gevormde epicardial afgeleide cellen (EPDCs) kunnen onderscheiden in verschillende cardiale celtypen, met inbegrip van de fibroblasten, zachte spiercellen, en potentieel cardiomyocytes en endotheliale cellen3, hoewel de differentiatie van de laatste twee cell bevolking blijft onderhevig aan debat (herzien in Smits et al. 4). bovendien de Epicard biedt leerzame paracrine signalen naar het myocardium te reguleren zijn groei en vascularisatie5,6,7,8. Meerdere studies hebben aangetoond dat verminderde epicardial formatie tot ontwikkelingsstoornissen gebreken in de hartspier9,10, therapieën11en geleiding systeem12 leidt, nadruk op de essentiële bijdrage van de Epicard tot de vorming van het hart.
Hoewel in het volwassen hart de Epicard aanwezig als een slapende laag is, wordt het geactiveerd op ischemie13. Epicardial reactivering na letsel recapituleert verscheidene van de processen beschreven voor cardiale ontwikkeling, met inbegrip van proliferatie en EMT14, zij het minder efficiënt. Interessant, hoewel het exacte mechanisme niet volledig begrepen is, de bijdrage van de epicardial te repareren kan worden verbeterd door behandeling met, bijvoorbeeld, Thymosin β415 of wijziging van VEGF-A mRNA16, wat resulteert in verbeterd cardiale functie na een myocardinfarct. De Epicard wordt derhalve geacht voor een interessante bron van de cel om endogene reparatie van de gewonde hart.
Mechanismen van de cardiale ontwikkeling zijn het vaak gerecapituleerd tijdens letsel, hoewel op een minder efficiënte wijze. Op zoek naar epicardial activators is het primordiaal dat wij kunnen bepalen en vergelijken van de volledige capaciteit van de foetale en volwassen Epicard. Bovendien, van een therapeutisch oogpunt, het is belangrijk dat we naast dierproeven, kennis over de reactie van de menselijke Epicard uitbreiden. Hier beschrijven we een methode om te isoleren en cultuur van de menselijke volwassen en foetale epicardial afgeleide cellen (EPDCs) in een epitheliale-cel-achtige morfologie en voor het opwekken van de EMT. Met dit model willen we verkennen en vergelijken volwassen en foetale epicardial cel gedrag.
Het belangrijkste voordeel van dit protocol is het gebruik van menselijke epicardial materiaal, dat is niet grondig onderzocht. Nog belangrijker is, biedt het beschreven isolatie en cel cultuur-protocol één uniforme methode om beide foetale en volwassen kasseistrook EPDCs, waardoor een directe vergelijking tussen deze twee mobiele bronnen worden afgeleid. Bovendien, aangezien de Epicard geïsoleerd op basis van de locatie is, het is ervoor gezorgd dat de cellen eigenlijk epicardially afgeleide17.
Menselijke EPDC isolatie methoden zijn eerder vastgesteld, afhankelijk deze meestal van uitgroei protocollen waar stukken van cardiale of epicardial weefsel zijn verzinkt op een cel cultuur schotel18,19. Deze aanpak kiest waardoor specifiek voor cellen die gedeeltelijk verliezen hun epitheliale fenotype om te migreren, en die zijn meer vatbaar voor spontane EMT ondergaan. In het huidige protocol, wordt eerst de Epicard verwerkt tot een enkele cel-oplossing waarmee de geïsoleerde EPDCs hun epitheliale toestand te handhaven. Deze methode biedt daarom een solide in vitro model voor het bestuderen van epicardial EMT.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschrijven we een gedetailleerd protocol te isoleren en cultuur primaire epicardial cellen afgeleid van menselijke volwassen en foetale hart. Uitgebreide karakterisering van deze cellen geweest eerder gepubliceerde17. We hebben aangetoond dat beide celtypes kunnen worden gehandhaafd als epitheliale cellen van de kasseien-achtige wanneer gekweekt met het ALK5 kinase inhibitor SB431542. EMT is een integraal onderdeel van het epicardial activatie in vivo tijdens zowel de ontwikkeling a…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek wordt ondersteund door de Nederlandse organisatie voor wetenschappelijk onderzoek (NWO) (VENI 016.146.079) en een onderzoek van het LUMC fellowship zowel AMS en LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Referências
- Smits, A. M., Dronkers, E., Goumans, M. J. The epicardium as a source of multipotent adult cardiac progenitor cells: Their origin, role and fate. Pharmacological research. 127, 129-140 (2017).
- Risebro, C. A., Vieira, J. M., Klotz, L., Riley, P. R. Characterisation of the human embryonic and foetal epicardium during heart development. Development. 142 (21), 3630-3636 (2015).
- Zhou, B., Ma, Q., et al. Epicardial progenitors contribute to the cardiomyocyte lineage in the developing heart. Nature. 454 (7200), 109-113 (2008).
- Smits, A., Riley, P. Epicardium-Derived Heart Repair. Journal of Developmental Biology. 2 (2), 84-100 (2014).
- Chen, T. H. P., Chang, T. C., et al. Epicardial Induction of Fetal Cardiomyocyte Proliferation via a Retinoic Acid-Inducible Trophic Factor. Biologia do Desenvolvimento. 250 (1), 198-207 (2002).
- Pennisi, D. J., Ballard, V. L. T., Mikawa, T. Epicardium is required for the full rate of myocyte proliferation and levels of expression of myocyte mitogenic factors FGF2 and its receptor, FGFR-1, but not for transmural myocardial patterning in the embryonic chick heart. Developmental Dynamics. 228 (2), 161-172 (2003).
- Lavine, K. J., Yu, K., et al. Endocardial and epicardial derived FGF signals regulate myocardial proliferation and differentiation in vivo. Developmental Cell. 8 (1), 85-95 (2005).
- Stuckmann, I., Evans, S., Lassar, A. B. Erythropoietin and retinoic acid, secreted from the epicardium, are required for cardiac myocyte proliferation. Developmental biology. 255 (2), 334-349 (2003).
- Männer, J., Schlueter, J., Brand, T. Experimental analyses of the function of the proepicardium using a new microsurgical procedure to induce loss-of-proepicardial-function in chick embryos. Developmental Dynamics. 233 (4), 1454-1463 (2005).
- Weeke-Klimp, A., Bax, N. A. M., et al. Epicardium-derived cells enhance proliferation, cellular maturation and alignment of cardiomyocytes. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 49 (4), 606-616 (2010).
- Eralp, I., Lie-Venema, H., et al. Coronary Artery and Orifice Development Is Associated With Proper Timing of Epicardial Outgrowth and Correlated Fas Ligand Associated Apoptosis Patterns. Circulation Research. 96 (5), (2005).
- Kelder, T. P., Duim, S. N., et al. The epicardium as modulator of the cardiac autonomic response during early development. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 89, 251-259 (2015).
- van Wijk, B., Gunst, Q. D., Moorman, A. F. M., van den Hoff, M. J. B. Cardiac regeneration from activated epicardium. PloS one. 7 (9), e44692 (2012).
- Zhou, B., Honor, L. B., et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. The Journal of clinical investigation. 121 (5), 1894-1904 (2011).
- Smart, N., Bollini, S., et al. De novo cardiomyocytes from within the activated adult heart after injury. Nature. 474 (7353), 640-644 (2011).
- Zangi, L., Lui, K. O., et al. Modified mRNA directs the fate of heart progenitor cells and induces vascular regeneration after myocardial infarction. Nature Biotechnology. 31 (10), 898-907 (2013).
- Moerkamp, A. T., Lodder, K., et al. Human fetal and adult epicardial-derived cells: a novel model to study their activation. Stem Cell Research & Therapy. 7 (1), 1-12 (2016).
- Clunie-O’Connor, C., Smits, A. M., et al. The Derivation of Primary Human Epicardium-Derived Cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. 35, 2C.5.1-2C.5.12 (2015).
- Van Tuyn, J., Atsma, D. E., et al. Epicardial Cells of Human Adults Can Undergo an Epithelial-to- Mesenchymal Transition and Obtain Characteristics of Smooth Muscle Cells In Vitro. Stem Cells. 25 (2), 271-278 (2007).
- Bax, N. A. M., van Oorschot, A. A. M., et al. In vitro epithelial-to-mesenchymal transformation in human adult epicardial cells is regulated by TGFβ-signaling and WT1. Basic research in cardiology. 106 (5), 829-847 (2011).
- Chechi, K., Richard, D. Thermogenic potential and physiological relevance of human epicardial adipose tissue. International Journal of Obesity Supplements. 5 (Suppl 1), S28-S34 (2015).
