L’isolement et la Culture de cellules primaires épicardiques spécimens de coeur adultes et du foetus humain
Summary
L’épicarde joue un rôle crucial dans le développement et la réparation du coeur en fournissant des cellules et facteurs de croissance à la paroi myocardique. Nous décrivons ici une méthode aux cellules humaines d’épicardique principale culture qui permet l’étude et la comparaison de leurs caractéristiques développementales et adultes.
Abstract
L’épicarde, une couche de cellules épithéliales couvrant le myocarde, a un rôle essentiel au cours du développement cardiaque, ainsi que dans la réponse de réparation du coeur après une lésion ischémique. Lorsqu’il est activé, les cellules épicardiques subissent un processus appelé épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT) pour assurer les cellules vers le myocarde en régénération. En outre, l’épicarde contribue par l’intermédiaire de la sécrétion de facteurs paracrines essentiel. Pour apprécier pleinement le potentiel de régénération de l’épicarde, un modèle de cellule humaine est nécessaire. Ici, nous présentons un modèle de culture cellulaire roman pour dériver des cellules dérivées épicardiques primaires (EPDCs) de tissu cardiaque adult et du foetus humain. Pour isoler le EPDCs, l’épicarde est disséqué de l’extérieur de l’échantillon de cœur et transformée en une suspension monocellulaire. Ensuite, les EPDCs sont plaqués et cultivées dans un milieu contenant l’inhibiteur de kinase-5 ALK SB431542 pour maintenir leur phénotype épithélial EPDC. EMT est induite par la stimulation avec TGFβ. Cette méthode permet, pour la première fois, l’étude du processus de l’humain EMT épicardique dans un milieu contrôlé et permet de gagner plus de perspicacité dans la sécrétome de EPDCs qui peut aider la régénération cardiaque. Par ailleurs, cette approche uniforme permet une comparaison directe des comportements humains adultes et foetale épicardique.
Introduction
L’épicarde, une couche épithéliale monocellulaires qu’enveloppes le coeur, est d’une importance vitale pour le développement cardiaque et réparation (examinées par Smits et al. 1). développemental, l’épicarde découle de l’orgue de proepicardial, une petite structure située à la base du cœur en voie de développement. Autour du jour du développement E9.5 à la souris et après la conception 4 semaines chez les humains, les cellules commencent à migrer à partir de cette structure de chou-fleur et de couvrir les pays en développement de myocarde2. Une fois qu’une couche unique de cellules épithéliales est formée, une partie des cellules épicardiques subit épithéliales de transition mésenchymateuse (EMT). Au cours de l’EMT, les cellules perdent leurs caractéristiques épithéliales, comme les adhérences cellule-cellule et obtenir un phénotype mésenchymateux qui leur donne la capacité de migrer dans le myocarde en voie de développement. Les cellules formées de dérivée épicardiques (EPDCs) peuvent se différencier en plusieurs types de cellules cardiaques, y compris les fibroblastes, cellules musculaires lisses et potentiellement cardiomyocytes et cellules endothéliales3, bien que la différenciation de ces derniers, deux cellules les populations reste sujette à débat (examinée par Smits et al. 4). en outre, l’épicarde fournit des signaux paracrines instructif sur le myocarde pour réguler sa croissance et la vascularisation5,6,7,8. Plusieurs études ont démontré qu’avec facultés affaiblies formation épicardique conduit à des anomalies du développement dans le muscle cardiaque9,10, système vasculaire11et conduction system12, mettant l’accent sur l’essentiel contribution de l’épicarde à la formation du cœur.
Bien qu’en plein adulte l’épicarde est présent sous une couche dormante, il devient réactivé après ischémie13. Après lésion de réactivation épicardique reprend plusieurs des processus décrits pour le développement cardiaque, y compris la prolifération et EMT14, quoique moins efficacement. Fait intéressant, bien que le mécanisme exact n’est pas entièrement compris, la contribution épicardique de réparer peut être améliorée par un traitement avec, par exemple, thymosine β415 ou modification ARNm de VEGF-A16, résultant en flexibilit cardiaque fonction après infarctus du myocarde. L’épicarde constitue donc une source intéressante de cellulaire pour améliorer la réparation endogène du cœur blessé.
Mécanismes du développement cardiaque sont souvent récapitulés lors de blessures, quoique de manière moins efficace. En quête d’activateurs épicardiques, il est primordial que nous pouvons déterminer et comparer la capacité totale de l’épicarde foetale et adulte. En outre, d’un point de vue thérapeutique, il est important que, en plus de l’expérimentation animale, nous étendons connaissance relativement à la réponse de l’épicarde humaine. Nous décrivons ici une méthode pour isoler et adultes et foetales épicardiques dérivées des cellules humaines (EPDCs) dans une morphologie épithéliale-cellule-comme la culture et d’induire des EMT. Avec ce modèle, notre objectif est d’explorer et de comparer le comportement cellulaire épicardique adultes et du foetus.
Le principal avantage de ce protocole est l’utilisation de matériel épicardique humain, qui n’a pas été soigneusement étudiée. Ce qui est important, le protocole de culture décrit isolement et cellule fournit une seule méthode uniforme pour calculer les deux galets foetale et adultes EPDCs, permettant une comparaison directe entre les sources de ces deux cellules. En outre, étant donné que l’épicarde est isolée en fonction de son emplacement, il est assuré que les cellules sont en fait que dérivée17.
Tandis que des méthodes d’isolement EPDC humaines ont été établis précédemment, ces dépendent principalement de protocoles excroissance où des morceaux de tissu cardiaque ou épicardique sont plaqués sur une cellule culture plat18,19. Cette approche sélectionne ainsi spécifiquement pour les cellules qui perdent partiellement leur phénotype épithélial afin de migrer, et qui sont plus susceptibles de subir une EMT spontanée. Dans le protocole actuel, l’épicarde est d’abord transformé en une solution de cellule unique qui permet à l’EPDCs isolés maintenir leur état épithélial. Cette méthode fournit donc un modèle solide en vitro afin d’étudier les EMT épicardique.
Protocol
Representative Results
Discussion
Nous décrivons ici un protocole détaillé d’isoler et de la culture des cellules primaires épicardiques dérivés de coeurs adultes et du foetus humains. Une caractérisation de ces cellules a été précédemment publié17. Nous avons montré que les deux types de cellules peuvent être maintenues tant que les cellules épithéliales de pavées comme lorsqu’il est cultivé avec l’inhibiteur de kinase de ALK5 SB431542. EMT est partie intégrante du épicardique activation in vivo…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Cette recherche est financée par l’Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (VENI 016.146.079) et une bourse de recherche de LUMC tant d’AMS et LUMC Bontius Stichting (MJG).
Materials
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium + GlutaMAX | Gibco | 21885-025 | |
| Medium 199 | Gibco | 31150-022 | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10270-106 | |
| Trypsin 0.25% | Invitrogen | 25200-056 | |
| Penicillin G sodium salt | Roth | HP48 | |
| Streptomycin sulphate | Roth | HP66 | |
| Trypsin 1:250 from bovine pancreas | Serva | 37289 | |
| EDTA | Sigma | E4884 | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Culture plates 6 well | Greiner bio-one | 657160 | |
| Culture plates 12 well | Corning | 3512 | |
| Culture plates 24 well | Greiner bio-one | 662160 | |
| SB 431542 | Tocris | 1614 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Merck | 102931 | |
| 100-1000µL Filtered Pipet Tips | Corning | 4809 | |
| 10-ml pipet | Greiner bio-one | 607180 | |
| 5-ml pipet | Greiner bio-one | 606180 | |
| Cell culture dish 100/20 mm | Greiner bio-one | 664160 | |
| PBS | Gibco | 10010056 | Or home-made and sterilized |
| Eppendorf tubes 1.5 mL | Eppendorf | 0030120086 | |
| 15-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 188271 | |
| 50-ml centrifuge tubes | Greiner bio-one | 227261 | |
| 10 mL Syringe | Becton Dickinson | 305959 | |
| Needles 19 Gauge | Becton Dickinson | 301700 | |
| Needles 21 Gauge | Becton Dickinson | 304432 | |
| EASYstrainer Cell Sieves, 100 µm | Greiner bio-one | 542000 | |
| TGFβ3 | R&D systems | 243-B3 | |
| Monoclonal Anti-Actin, α-Smooth Muscle | Sigma | A2547 | |
| Anti-Mouse Alexa Fluor 555 | Invitrogen | A31570 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen | A12379 | |
| Equipment | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pipet P1,000 | Gilson | F123602 | |
| Pipet controller | Integra | 155 015 | |
| Stereomicroscope | Leica | M80 | |
| Inverted Light Microscope | Olympus | CK2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5702 | |
| Waterbath | GFL | 1083 |
Referências
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