Высокая пропускная способность SiRNA скрининга для хлорпикрина и фтористый водород индуцированной роговицы травм эпителиальных клеток
Summary
Высокая пропускная способность небольшой тормозящий РНК скрининга является важным средством, которое могло бы способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. Здесь мы представляем, разработки и проверки воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности скрининга индуцированной фтористого водорода и хлорпикрина эпителиальных травмы роговицы.
Abstract
Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. Лечение для токсикант индуцированной повреждение роговицы в целом поддерживают как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. В усилиях по разработке методов лечения и терапии для ухода за воздействия он может быть важно понимать молекулярных и клеточных механизмов этих травм. Мы предлагаем, что использование высокой пропускной способности небольшой тормозящий РНК (siRNA) скрининга может быть важным инструментом, который может способствовать более быстро выяснить молекулярных механизмов химических роговицы эпителиальных травмы. siRNA, двойной мель молекулы РНК которые длиной 19-25 нуклеотидов и использовать post-transcriptional экспрессию путь к деградации мРНК гена имеющие гомологичностью к siRNA. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. В этой статье представлены разработки и проверки в vitro воздействия моделей и методов для высокой пропускной способности, скрининг (HTS)-фтористый водород (HF) и хлорпикрина (CP) индуцированной глазные травмы. Хотя мы выбрали этих двух токсикантов, наши методы применимы к изучению других ядовитых веществ с незначительными изменениями в протоколе токсиканта экспозиции. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и производства ИЛ-8 были выбраны в качестве конечных точек в протоколе проверки. Представлены методы культуры клетки, подходящие для HTS исследования и несколько проблем, связанных с развитием токсиканта воздействия. Создание моделей HTS для этих ядовитых веществ позволяет дальнейшие исследования, чтобы лучше понять механизм травмы и экран для потенциальных терапии для химических глазные травмы.
Introduction
Токсикант индуцированной глазные травмы является истинной глазной неотложной помощи, потому что химические вещества имеют потенциал, чтобы быстро нанести повреждения значительные тканей. К сожалению лечение токсикант индуцированной повреждение роговицы только в целом поддерживают, как существуют без конкретных терапии для лечения этих травм. Текущая стратегия лечения неспецифических и главным образом включает в себя актуальные терапевтических процедур, таких как смазки, антибиотики, и cycloplegics следуют противовоспалительные средства (например, стероиды) когда роговица заново грануломах1 ,2. Несмотря на лучших текущие терапевтического лечения вариантов Долгосрочный прогноз обычно плохо из-за прогрессивного помутнение роговицы и неоваскуляризации2,3.
Животные модели традиционно использовались для изучения токсичности химических и понять механизмы повреждения. Однако исследования на животных, трудоемким и дорогим. Есть также усилия по сокращению животных испытаний. Например законодательство REACH (ЕС 1907/2006) в Европейском союзе имеет положения, призванные уменьшить животных испытаний. Положения включают требование компании обмениваться данными с целью избежать животных тестирования и получения одобрения от Европейского Химического Агентства до выполнения предложенных испытаний на животных. Согласно положениям ДОСЯГАЕМОСТИ испытания на животных должно быть последним средством. Существует также Европейский Косметика Регламент (EC 1223/2009), поэтапное тестирование косметики в животных. Когда проводятся исследования на животных, они руководствуются принципами 3Rs (уточнение, сокращение и замены), которые обеспечивают основу для выполнения более гуманных исследований на животных, уменьшая количество животных, используемых и использования альтернатив без использования животных там, где это возможно. По этим причинам поле токсикологии стремилась принять в vitro анализов, которые может обеспечить понимание молекулярных механизмов токсичности и может быть сделано в более высокой пропускной способностью4. Это подход, функциональные токсикологии, где токсикантов определены их функции, а не только их химии. Шаг дальше, функциональные токсикогеномике стремятся понять роль(и), что конкретные гены играют в воздействии ядовитых веществ5. С применением технологии siRNA экраны расследовать ген функции в молекулярных и клеточных ответов токсикантов может быть сделано с высокой пропускной способностью. двойной мель молекулы РНК, которые 19-25 нуклеотидов, длинные, что воспользоваться пост транскрипционный анализ гена глушителей пути в всех mammalian клеток6siRNA. Эти синтетически сделал и направленная на конкретный ген. Когда введена в ячейку, обрабатывается siRNA и одной нити, нити руководства, загружается в РНК-комплекс (RISC). SiRNA направляет RISC на взаимодополняющих региона в молекуле мРНК, и RISC снижается мРНК. Это приводит к снижению экспрессии определенных генов. Экспрессия гена конкретные сокращения могут затем учился в токсиканта подвергаются клетки, чтобы определить функцию этого гена в клеточный ответ на токсикант. Такой подход был использован для более глубокого понимания механизмов рицин восприимчивость и индукции AHR-зависимые CYP1A17,8.
Оценки риска химического терроризма (CTRA) список и токсических промышленных химикатов (TIC) списки расписаны выберите химических веществ на основе их токсичность и потенциал, чтобы быть выпущен во время террористической, войны или промышленной аварии событий9. Мы применяем siRNA высокой пропускной способности, скрининг (HTS) toxicogenomic подход к изучению CTRA список ядовитых веществ, которые были определены на высокий риск использования в террористических целях. Традиционные токсикологии стремится понять неблагоприятные воздействия химических веществ на живых организмов; Однако, у нас есть еще желание понять механизмы повреждения с целью информирования развитие терапии и терапевтических подходов и, возможно, обнаружить молекул, которые могут быть направлены терапевтических развития. Эти усилия в некоторых отношениях можно считать аналогично использованию высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга и ячейки на основе анализов в процесс обнаружения наркотиков10. Основное отличие бы что что лекарств обычно стремится особой мишенью для терапевтических обнаружения, в то время как в наш подход несколько маловероятно, что будет сингулярных цели с высокую терапевтическую ценность для лечения токсиканта воздействия. Мы ожидаем, что любой парадигмы эффективного лечения для экспозиции токсиканта потребует многогранного подхода к достижению высокую терапевтическую ценность, и toxicogenomic данных жизненно могут сообщить парадигмы эффективного лечения.
Benchtop автоматизации приносит высокую пропускную способность методологии в лабораториях за пределами фармацевтической и биотехнологической промышленности. В vitro исследования в нашем институте исторически традиционной анализов, которые имеют низкую пропускную способность11,12,13. В последние несколько лет наша лаборатория перешел к использованию benchtop робототехники для выполнения высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Здесь мы представляем уточнение модели глазной клеток и развитие в vitro методы воздействия фтористого водорода (HF) и хлорпикрина (CP) подходит для высокой пропускной способности малых интерферирующих РНК скрининга. Наша цель – определить молекулы, которые регулируют клеточных повреждений в ответ на эти токсикантов. Целей siRNA библиотеки, которую мы выбрали включают G белка-рецепторы, протеинкиназы, протеаз, фосфатаз, ионных каналов и других потенциально druggable целей. ВЧ и CP были отобраны для исследования перекрестных CTRA список агентов с ToxNet доклады промышленных аварий найти тех, которые представляют наибольшую опасность глазных травм через пара воздействия9,14. CP (химическая формула Cl3CNO2, номер КАС 76-06-2) первоначально использовался как слезоточивый газ в первой мировой войне15. В настоящее время он используется в качестве сельскохозяйственного фумигант и функции как нематоцидной, фунгицидов и инсектицидов16. Фтористый водород (HF) используется в процессах, включая алкилирования нефтеперерабатывающих и электрохимическое фторирование органических соединений17. ВЧ (химическая формула HF, номер КАС 62778-11-4) газ, но в виде водного раствора кислоты фтористоводородной раствор (ЗДВ, CAS номер 7664-39-3). Таким образом, мы избрали использование ЗДВ в нашей в ячейки модели воздействия. Антиген большой T SV40 увековечен линии эпителиальных клеток человека роговицы, SV40-НСЕС был выбран для изучения. Жизнеспособность клеток и воспалительных маркер ИЛ-8 были отобраны как конечные точки, потому что цели, которые участвуют в клеточном травмы должны быть отражены в смерти клетки и воспалительной реакции. В частности если целевой играть защитную роль в экспозиции токсиканта, гибель клеток и/или воспалительных цитокинов производства следует увеличить когда целевое выражение тормозится siRNA. Обратное было бы верно для целей, которые играют негативную роль. Кроме того хроническое воспаление, как представляется, играть определенную роль в патологии роговицы после облучения и вмешательство в pathways смерти клетки может улучшить клинические исходы2,18.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мы описываем наши методы и результаты на развитие высокой пропускной способности роговицы эпителиальных клеток, скрининг модель для изучения ВЧ и CP травм. Мы также представляем результаты от первичного siRNA экрана для ВЧ травмы. Там было много проблем для разработки моделей HTS для …
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано, национальных институтов из здравоохранения противодействовать программа межведомственного соглашения # AOD13015-001. Мы хотели бы поблагодарить Стефани Froberg и Питер Херст за их усилия и опыт на видео-продукции.
Materials
| Bravo liquid handing platform | Agilent or equivalent | G5409A | |
| Bravo plate shaker | Agilent or equivalent | Option 159 | |
| Bravo 96LT disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 178 | 96-channel large tip pipetting head unit |
| Bravo 96ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 177 | 96-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 384ST disposable tip head | Agilent or equivalent | Option 179 | 384-channel small tip pipetting head unit |
| Bravo 96 250 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19477-022 | |
| Bravo 384 30 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| Bravo 384 70 μL sterile barrier tips | Agilent or equivalent | 19133-212 | |
| EnSpire multimode plate reader | Perkin Elmer or equivalent | 2300-0000 | AlphaLISA assay detector with high power laser excitation |
| IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit | Perkin Elmer or equivalent | AL224F | no-wash bead-based assay |
| ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates | Perkin Elmer or equivalent | 6008359 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen or equivalent | 13778500 | Transfection reagent |
| Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium | Invitrogen or equivalent | 31985070 | |
| TrypLE Express | Gibco or equivalent | 12605010 | Cell detachment solution |
| IncuCyte Zoom | Essen Instruments or equivalent | ESSEN BIOSCI 4473 | Incubator-housed automated microscope |
| Chloropicrin | Trinity Manufacturing or equivalent | N/A | Acute toxicity and irritant |
| DMEM-F12 cell culture medium | Invitrogen or equivalent | 11330-057 | Contains HEPES |
| Fetal bovine serum | Invitrogen or equivalent | 1891471 | |
| Human epidermal growth factor (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | E9644-.2MG | |
| Recombinant human insulin (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 12585-014 | |
| Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade) | Invitrogen or equivalent | 15140122 | |
| Hydrocortisone (cell culture grade) | Sigma or equivalent | H0888-10G | |
| Glucose (cell culture grade) | Sigma or equivalent | G7021 | |
| PBS (cell culture grade) | Sigma or equivalent | P5493 | |
| siRNA | Dharmacon or equivalent | various | |
| Thiazolyl blue tetrazolium bromide | Sigma or equivalent | M5655 | MTT assay substrate |
| siRNA buffer | Thermo or equivalent | B002000 | |
| 96-well cell culture plates | Corning or equivalent | CLS3595 | |
| T150 cell culture flasks | Corning or equivalent | CLS430825 | |
| BSL-2 cell culture hood | Nuaire or equivalent | NU-540 | |
| 300 mL robotic reservoirs | Thermo or equivalent | 12-565-572 | |
| 96 baffled automation reservoirs | Thermo or equivalent | 1064-15-8 | |
| 500 mL sterile disposable storage bottles | Corning or equivalent | CLS430282 | |
| Microplate heat sealer | Thermo or equivalent | AB-1443A | |
| Microplate heat sealing foil | Thermo or equivalent | AB-0475 | |
| Cardamonin | Tocris or equivalent | 2509 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| SKF 86002 | Tocris or equivalent | 2008 | Anti-inflammatory, used as positive control |
| DMSO | Sigma or equivalent | D8418 | |
| 48% hydrofluoric acid | Sigma or equivalent | 339261 | Corrosive and acute toxicity |
| 1000 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014382 | |
| 200 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014391 | |
| 20 μL Single channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014392 | |
| 1000 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17014497 | |
| 200 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013810 | |
| 20 μL 12-channel pipettors | Rainin or equivalent | 17013808 | |
| Pipettor tips 1000 μL | Rainin or equivalent | 17002920 | |
| Pipettor tips 200 μL | Rainin or equivalent | 17014294 | |
| Pipettor tips 20 μL | Rainin or equivalent | 17002928 | |
| Chemical fume hood | Jamestown Metal Products | MHCO_229 | |
| 384-well sample storage plates | Thermo or equivalent | 262261 | |
| Sodium chloride | Sigma or equivalent | S6191 | |
| 50 mL conical tubes | Thermo or equivalent | 14-959-49A | |
| Serological pipettes 50 mL | Corning or equivalent | 07-200-576 | |
| Serological pipettes 25 mL | Corning or equivalent | 07-200-575 | |
| Serological pipettes 10 mL | Corning or equivalent | 07-200-574 | |
| Serological pipettes 5 mL | Corning or equivalent | 07-200-573 | |
| SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells | N/A | N/A | These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article |
| Sceptor Handheld Automated Cell Counter | Millipore or equivalent | PHCC20060 | |
| GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument | Affymetrix or equivalent | 00-0372 | |
| Affymetrix 24- and 96-array plates | Affymetrix or equivalent | 901257; 901434 | |
| Draegger tube HF | Draeger or equivalent | 8103251 | |
| Draegger tube CP | Draeger or equivalent | 8103421 | |
| Draegger pump | Draeger or equivalent | 6400000 | |
| Clear Plate seals | Resesarch Products International or Equivalent | 202502 | |
| Reagent reservoirs | VistaLab Technologies or equivalent | 3054-1000 | |
| Xlfit | IDBS or equivalent | N/A | Excel add-in used for automated curve fitting |
Referências
- Randleman, B., Hampton, R. . Drugs, Diseases and Procedures. , (2011).
- Fish, R., Davidson, R. S. Management of ocular thermal and chemical injuries, including amniotic membrane therapy. Current Opinion in Ophthalmology. 21 (4), 317-321 (2010).
- Wang, X. A review of treatment strategies for hydrofluoric acid burns: current status and future prospects. Burns. 40 (8), 1447-1457 (2014).
- Gaytan, B. D., Vulpe, C. D. Functional toxicology: tools to advance the future of toxicity testing. Frontiers in Genetics. 5, 110 (2014).
- North, M., Vulpe, C. D. Functional toxicogenomics: mechanism-centered toxicology. International Journal of Molecular Sciences. 11 (12), 4796-4813 (2010).
- McManus, M. T., Sharp, P. A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs. Nature Reviews Genetics. 3 (10), 737-747 (2002).
- Bassik, M. C. A systematic mammalian genetic interaction map reveals pathways underlying ricin susceptibility. Cell. 152 (4), 909-922 (2013).
- Solaimani, P., Damoiseaux, R., Hankinson, O. Genome-wide RNAi high-throughput screen identifies proteins necessary for the AHR-dependent induction of CYP1A1 by 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin. Toxicological Sciences. 136 (1), 107-119 (2013).
- Cox, J. A., Gooding, R., Kolakowski, J. E., Whitmire, M. T. . Chemical Terrorism Risk Assessment; CSAC 12-006. , (2012).
- Zang, R., Li, D., Tang, I., Wang, J., Yang, S. Cell-Based Assays in High-Throughput Screening for Drug Discovery. International Journal of Biotechnology for Wellness Industries. 1, 31-51 (2012).
- Ray, R., Hauck, S., Kramer, R., Benton, B. A convenient fluorometric method to study sulfur mustard-induced apoptosis in human epidermal keratinocytes monolayer microplate culture. Drug and Chemical Toxicology. 28 (1), 105-116 (2005).
- Ruff, A. L., Dillman, J. F. Sulfur mustard induced cytokine production and cell death: investigating the potential roles of the p38, p53, and NF-kappaB signaling pathways with RNA interference. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 24 (3), 155-164 (2010).
- Smith, W. J., Gross, C. L., Chan, P., Meier, H. L. The use of human epidermal keratinocytes in culture as a model for studying the biochemical mechanisms of sulfur mustard toxicity. Cell Biology and Toxicology. 6 (3), 285-291 (1990).
- . . Toxnet. , (2016).
- Bancroft, W. D. . The Medical Department of the United States Army in the World War. 14, (1926).
- . . Chloropicrin Risk Characterization Document. , (2012).
- Aigueperse, J., et al. . Fluorine Compounds, Inorganic. Ullmann’s Encyclopedia of Industrial Chemistry. , (2000).
- Sotozono, C. Second Injury in the Cornea: The Role of Inflammatory Cytokines in Corneal Damage and Repair. Cornea. 19 (6), S155-S159 (2000).
- . . Guidelines and Recommendations for Dharmacon siRNA Libraries. , (2015).
- . . Lipofectamine RNAiMAX Reagent. , (2017).
- Denizot, F., Lang, R. Rapid colorimetric assay for cell growth and survival. Modifications to the tetrazolium dye procedure giving improved sensitivity and reliability. Journal of Immunological Methods. 89 (2), 271-277 (1986).
- . . IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit, 5,000 Assay Points. , (2016).
- Araki-Sasaki, K. An SV40-immortalized human corneal epithelial cell line and its characterization. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (3), 614-621 (1995).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. Journal of Biomolecular Screening. 4 (2), 67-73 (1999).
- Ruff, A. L. Development of a mouse model for sulfur mustard-induced ocular injury and long-term clinical analysis of injury progression. Cutaneous and Ocular Toxicology. 32 (2), 140-149 (2013).
- . . GeneTitan MC Instrument North America/Japan (110V). , (2018).
- Zhang, X. D. A pair of new statistical parameters for quality control in RNA interference high-throughput screening assays. Genomics. 89 (4), 552-561 (2007).
- He, H. Effect of Sodium Fluoride on the Proliferation and Gene Differential Expression in Human RPMI8226 Cells. Biological Trace Element Research. 167 (1), 11-17 (2015).
- Tabuchi, Y., Yunoki, T., Hoshi, N., Suzuki, N., Kondo, T. Genes and gene networks involved in sodium fluoride-elicited cell death accompanying endoplasmic reticulum stress in oral epithelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 15 (5), 8959-8978 (2014).
- Pesonen, M. Chloropicrin-induced toxic responses in human lung epithelial cells. Toxicology Letters. 226 (2), 236-244 (2014).
- Wilhelm, S. N., Shepler, K., Lawrence, L. J., Lee, H., Seiber, J. N., et al. . Fumigants: Environmental Fate, Exposure, and Analysis. 652, (1997).
- Adamek, E., Pawlowska-Goral, K., Bober, K. In vitro and in vivo effects of fluoride ions on enzyme activity. Annales Academiae Medicae Stetinensis. 51 (2), 69-85 (2005).
- Heard, K., Hill, R. E., Cairns, C. B., Dart, R. C. Calcium neutralizes fluoride bioavailability in a lethal model of fluoride poisoning. Journal of Toxicology: Clinical Toxicology. 39 (4), 349-353 (2001).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Casida, J. E. Chloropicrin: reactions with biological thiols and metabolism in mice. Chemical Research in Toxicology. 10 (9), 1001-1007 (1997).
- Sparks, S. E., Quistad, G. B., Li, W., Casida, J. E. Chloropicrin dechlorination in relation to toxic action. Journal of Biochemical and Molecular Toxicology. 14 (1), 26-32 (2000).
- Byron, K. A., Varigos, G., Wootton, A. Hydrocortisone inhibition of human interleukin-4. Immunology. 77 (4), 624-626 (1992).
- van der Poll, T., Lowry, S. F. Lipopolysaccharide-induced interleukin 8 production by human whole blood is enhanced by epinephrine and inhibited by hydrocortisone. Infection and Immunity. 65 (6), 2378-2381 (1997).
- Solomon, A. Doxycycline inhibition of interleukin-1 in the corneal epithelium. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41 (9), 2544-2557 (2000).
- Mishra, P. K. Mitochondrial oxidative stress-induced epigenetic modifications in pancreatic epithelial cells. International Journal of Toxicology. 33 (2), 116-129 (2014).
- Stockholm, D. The origin of phenotypic heterogeneity in a clonal cell population in vitro. PLoS One. 2 (4), e394 (2007).
- . . ATCC Animal Cell Culture Guide. , (2014).
- Lundholt, B. K., Scudder, K. M., Pagliaro, L. A simple technique for reducing edge effect in cell-based assays. Journal of Biomolecular Screening. 8 (5), 566-570 (2003).
- Mpindi, J. P. Impact of normalization methods on high-throughput screening data with high hit rates and drug testing with dose-response data. Bioinformatics. 31 (23), 3815-3821 (2015).
- Zhang, X. D. Illustration of SSMD, z score, SSMD*, z* score, and t statistic for hit selection in RNAi high-throughput screens. Journal of Biomolecular Screening. 16 (7), 775-785 (2011).
