Chloropicrin 및 수소 불 화물 유발 각 막 상피 세포 상해에 대 한 높은 처리량 SiRNA 심사

Summary

높은 처리량 작은 금지 RNA 검사 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구입니다. 여기, 우리는 개발 및 노출 모델 및 각 막 상피 부상 수소 불 화물 그리고 chloropicrin 유도의 높은 처리량 검열 방법의 유효성 검사 제시.

Abstract

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 아무 특정 치료제가이 부상 치료 존재 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료는 일반적으로 지원. 치료 및 노출에 대 한 관심에 치료제를 개발 하는 노력, 그것은이 상해의 분자 및 세포 메커니즘을 이해 하는 것이 중요 수. 있습니다 우리는 높은 처리량 작은 금지 RNA (siRNA) 심사의 활용 화학 각 막 상피 상해의 분자 메커니즘을 더 빠르게 명료를 도울 수 있는 중요 한 도구가 될 수 있습니다 제안 합니다. siRNA는 siRNA에 상 동을가지고 있는 19-25의 뉴클레오티드 긴 mRNA를 저하 하는 통로 입을 post-transcriptional 유전자를 활용 더블 좌초 RNA 분자는. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 개발 및 체 외에 노출 모델 및 수소 불 화물 (HF) 및 chloropicrin (CP) 유도 눈 부상 (HTS)을 상영 하는 높은 처리량 방법의 유효성 검사는이 문서에 표시 됩니다. 하지만 우리는 이러한 두 가지 유독 선택, 우리의 방법 toxicant 노출 프로토콜에 사소한 수정 다른 유독의 연구에 적용 됩니다. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포 생존 능력 및 IL-8 생산 심사 프로토콜에서 끝점으로 선정 됐다. Toxicant 노출의 개발와 관련 된 몇 가지 과제 고 셀 문화 방법 HTS 연구에 대 한 적합 한 표시 됩니다. 이 유독 HTS 모델 설립 화학 눈 부상에 대 한 잠재적인 치료에 대 한 화면을 상해의 메커니즘을 이해 하기 더 연구에 대 한 수 있습니다.

Introduction

Toxicant 유도 눈 부상 화학 빠르게 상당한 조직 손상을 입힐 잠재력을가지고 있기 때문에 진정한 눈 비상 이다. 불행 하 게도, 아니 특정 치료제가이 부상 치료 존재에 toxicant 유발 각 막 부상에 대 한 치료 일반적으로 지원만 있습니다. 현재 치료 전략 일반적인 주로 같은 윤활제, 항생제, 국 소 치료 요법을 포함 하 고 cycloplegics 뒤에 소염제 (예를 들어, 스테로이드) 한 번 각 막^{1 epithelialized 다시 있다 ,2}. 최고의 현재 치료 치료 옵션을 사용할에 불구 하 고 장기적인 예 후는 일반적으로 진보적인 각 막 흐려 및 neovascularization^2,3가난.

동물 모델 화학 독성을 조사 하 고 상해의 메커니즘을 이해를 전통적으로 사용 되어 왔습니다. 그러나, 동물 연구는 시간이 소모 되 고 비싸다. 노력을 줄이기 위해 동물 실험도 있다. 예를 들어 유럽 연합에 도달 법안 (EC 1907/2006)를 동물 실험을 줄이기 위한 규정 있다. 규정 회사 동물 테스트 및 동물에 제안 된 테스트를 수행 하기 전에 유럽 화학 제품 기관에서 승인을 얻는 피하기 위하여 데이터 공유 요구 사항이 포함 됩니다. 규정에 따라 동물 실험 최후의 수단 이어야 한다. 또한 단계적으로 동물에서 화장품의 테스트 유럽 화장품 규정 (EC 1223/2009)이 있다. 동물 연구를 실시 하는 경우 그들이 3Rs의 원칙에 의해 인도 된다 (구체화, 감소, 및 교체), 더 자비 롭 동물 연구를 수행, 사용, 동물의 수를 감소 및 비 동물 대안을 사용 하 여 프레임 워크를 제공 하는 가능한 경우. 이러한 이유로 독물학 분야는 독성의 분자 메커니즘에 대 한 통찰력을 제공할 수 있습니다 하 고 높은 처리량⁴에서 행 해질 수 있다 생체 외에서 분석을 채택 하고자 결정 했다. 이것은 기능 독극물 접근 어디 유독 전적으로 그들의 화학에 의해 보다는 오히려 그들의 기능에 의해 정의 됩니다. 단계는 또한, 기능 toxicogenomics 추구 특정 유전자 유독⁵의 효과에서 재생 역할을 이해 하. SiRNA 기술을 응용, 유독에 분자와 세포질 응답에 유전자 기능을 조사 하기 위해 화면 높은 처리량에 수행할 수 있습니다. siRNA는 19-25의 뉴클레오티드 긴 포스트 transcriptional 유전자 입을 통로 모든 포유류 세포⁶에 활용 하는 두 배 좌초 된 RNA 분자. 이 종합적으로 만들어지고 특정 유전자를 대상으로 설계 된. 셀에 도입 하는 경우는 siRNA 처리 되 고 한 가닥, 가이드 물가 RNA 유도 입을 복잡 한 (RISC)에 로드 됩니다. siRNA는 mRNA 분자에 상호 보완적인 영역에 RISC 지시 하 고 있는 RISC 저하는 mRNA. 특정 유전자의 표정 감소 결과. 특정 유전자의 표현의 결과 감소는 toxicant에 세포질 응답에 그 유전자의 기능을 확인 toxicant 노출된 셀에 다음 공부 수 있습니다. 이러한 접근은 더욱 CYP1A1^7,8의 a h R-종속 유도 리 민감성의 메커니즘 이해 하 사용 되었습니다.

화학 테러 위험 평가 (CTRA) 목록 및 독성 산업용 화학 물질 (TIC) 목록 선택 화학 물질의 독성과 테러, 전쟁, 또는 산업 재해 이벤트⁹중 출시 될 가능성에 따라 항목별로 나 누이고 있다. 우리는 siRNA 높은 처리량 검열 (HTS) toxicogenomic 접근 테러 사건에서 사용의 높은 위험에 확인 된 CTRA 목록 이용과의 연구에 적용 하 고 있다. 화학 생물;에 있는 불리 한 효과 이해 하고자 하는 전통적인 독물학 그러나, 우리는 더 욕망의 치료제 및 치료 접근을 가능 하 게, 개발을 알리는 목적으로 상해의 메커니즘을 이해 하는 분자 치료 개발에 대 한 대상으로 지정할 수 있는 발견. 몇 가지 방법으로이 노력 유사한 높은 처리량 siRNA 심사 및 약 발견 과정¹⁰에서 셀 기반 분석의 사용을 고려할 수 있습니다. 주요 차이점은 우리의 접근 방식에 다소 가능성이 크다 toxicant 노출의 치료에 대 한 높은 치료 가치와 단일 대상 될 것 이다 반면 그 약물 발견 일반적으로 치료 발견에 대 한 단 수 목표를 추구 될 것 이다. 우리 예상 어떤 효과적인 치료 패러다임 toxicant 노출에 대 한 높은 치료 가치를 달성 하는 다각적인 접근 방식이 필요로 하 고 toxicogenomic 데이터 극히 효과적인 치료 패러다임을 알릴 수 있습니다.

벤치탑 자동화 실험실 제약 또는 생명 공학 산업 밖에 서 높은 처리량 방법론을 제공합니다. 우리 연구소에서 생체 외에서 연구 역사적으로 낮은 처리량^11,,1213전통적인 분석 되었습니다. 지난 몇 년 동안, 우리의 실험실 벤치탑 높은 처리량 siRNA 심사를 수행 하기 위해 로봇의 사용에 전환 했다. 여기, 우리가 현재 눈 셀 모델의 세련미와 체 외에서 의 개발 수소 불 화물 (HF)와 chloropicrin (CP) 높은 처리량 siRNA 심사 적합에 대 한 노출 방법. 우리의 목표는 이러한 유독 응답에 세포질 상해를 조절 하는 분자를 식별 하는. 우리는 선택 하는 siRNA 도서관의 목표는 G 단백질 결합 된 수용 체, 단백질 kinases, 프로 테아 제, 가수분해, 이온 채널, 그리고 다른 잠재적으로 druggable 대상 포함 됩니다. HF와 CP 선정 됐다 연구에 대 한 상호 CTRA 목록 에이전트 산업 사고의 ToxNet 보고서를 통해 증기 노출^9,14눈 상해의 가장 중대 한 모험을 선물 하는 그를 찾을 수 있습니다. WWI¹⁵에 최 루 가스 CP (Cl₃CNO₂화학식, CAS 번호 76-06-2) 원래 사용 했다. 현재¹⁶nematicide, 살 균 제, 살충제는 농업 fumigant 및 기능으로 사용 됩니다. 수소 불 화물 (HF)는 정유 및 화학 fluorination 유기 화합물¹⁷의 알을 포함 하 여 프로세스에서 사용 됩니다. HF (화학식 HF, CAS 번호 62778-11-4)는 가스 이지만 수성 형태로 소산 (HFA, CAS 번호 7664-39-3). 따라서, 우리가 우리의 셀 HFA를 사용 하 여 선출 노출 모델. SV40 큰 T 항 원 SV40 HCEC 연구에 대 한 선정 되었다 인간 각 막 상피 세포 선 불후. 세포질 상해에 관련 된 목표 세포 죽음과 선 동적인 응답에 반영 해야 하기 때문에 세포 생존 능력 및 염증 성 마커 IL-8 끝점으로 선정 됐다. 특히, 대상 toxicant 노출에서 보호 역할을 한다면, 세포 죽음 또는 염증 성 cytokine 생산 증가 한다 때 대상 식 siRNA에 의해 저해. 반대로 부정적인 역할을 하는 대상에 대 한 사실 것입니다. 또한, 만성 염증 후 노출, 및 세포 죽음 통로 있는 내정간섭에 임상 결과^2,18이 향상 시킬 수 있습니다 각 막 병 리에 역할을 나타납니다.

Protocol

1. 세포 문화 유지 보수 37 ° C, 5% CO2, 그리고 15% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS)과 DMEM F-12에서 90% 습도에서 셀 라인 SV40-HCEC 성장 1 %L-글루타민, 10 µ g/L 표 피 성장 인자 (EGF), 그리고 5 mg/L 인슐린. 셀 라인 (시드 밀도)에 따라 3 ~ 4 일 마다 그 confluency는 결코 문화 유지 관리 중 80%를 초과 하도록 통로. 플라스 크를 사용 하 여 분리 솔루션 (모든 150 c m2 플라스 크에 대 한 14 …

Representative Results

노출 방법 개발 우리는 세련 하 고 HTS 연구에 사용 하기 위해 인간 각 막 상피 세포 선 SV40-HCEC의 적합성을 평가. SV40 HCEC SV 40 큰 T 항 원을 사용 하 여 불멸 하 게 했다 고 Dhanajay Pal23에서 선물 했다. 간결 하 게, 여기 제시 노출 방법론 개발에 탐구 하는 너무 많은 변수가 있었고 그래서, 우리가 생각 …

Discussion

본 모델의 HF와 CP 부상 연구에 대 한 심사는 높은 처리량 각 막 상피 세포의 개발에 우리의 방법 및 결과 설명 우리. 우리는 또한 HF 부상에 대 한 기본 siRNA 화면에서 결과 제시. TIC 상해 연구를 위한 HTS 모델의 개발에 많은 도전을 했다. 우리가 셀 문화 모델에 HF, HFA 또는 CP의 연구와 관련 된 문학에서 찾을 수 있는 방법은 작은 도움의 이었다. 불 소 이온에 대부분 생체 외에서 연구 구강 세포?…

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting