Hög genomströmning SiRNA Screening för klorpikrin och vätefluorid-inducerad hornhinnan epitelial Cell skada

Summary

Hög genomströmning små hämmande RNA screening är ett viktigt verktyg som kan bidra till snabbare klarlägga molekylära mekanismer för kemiska hornhinnan epitelial skador. Vi presenterar häri, utveckling och validering av exponering modeller och metoder för high throughput screening av vätefluorid – och klorpikrin-inducerad hornhinnan epitelial skador.

Abstract

För människor-inducerad okulär skada är en sann okulär nödsituation eftersom kemikalier har potential att snabbt orsaka betydande vävnadsskada. Behandlingar för människor-inducerad korneal skada är allmänt stödjande som inga specifika therapeutics finns för att behandla dessa skador. I arbetet med att utveckla behandlingar och läkemedel för att ta hand om exponering, kan det vara viktigt att förstå de molekylära och cellulära mekanismerna av dessa skador. Vi föreslår att utnyttjande av hög genomströmning små hämmande RNA (siRNA) screening kan vara ett viktigt verktyg som kan bidra till snabbare klarlägga molekylära mekanismer för kemiska hornhinnan epitelial skador. siRNA är dubbel stranded RNA molekyler som är 19-25 nukleotider långa och utnyttja den post-transcriptional nedtystning väg för att försämra mRNA som har homologi till siRNA. Den resulterande minskningen av uttryck av specifika genen kan sedan studeras i toxiska exponerade cellerna att kontrollera funktionen av denna gen den cellulära svar på den för människor. Utveckling och validering av in vitro- exponering modeller och metoder för hög genomströmning screening (HTS) av vätefluorid (HF) och klorpikrin-(CP) inducerad okulär skada presenteras i denna artikel. Även om vi valt dessa två ämnen, är våra metoder tillämpliga på studiet av andra gifter med smärre ändringar till protokollet toxiska exponering. SV40 stora T antigenet förevigade mänsklig korneal epitelial cell linje SV40-HCEC valdes ut för studien. Cellernas viabilitet och IL-8 produktion valdes som slutpunkter i protokollet screening. Flera utmaningar associerade med utveckling av toxiska exponering och cell kultur metoder passar HTS studier presenteras. Inrättandet av HTS modeller för dessa gifter kan ytterligare undersökningar för att bättre förstå mekanismen av skada och till skärmen för potentiella therapeutics för kemiska okulär skada.

Introduction

För människor-inducerad okulär skada är en sann okulär nödsituation eftersom kemikalier har potential att snabbt orsaka betydande vävnadsskada. Behandlingar för människor-inducerad korneal skada finns tyvärr bara allmänt stödjande som inga specifika therapeutics finns för att behandla dessa skador. Den nuvarande behandlingsstrategin är ospecifika och främst inkluderar aktuella terapeutiska behandlingar såsom smörjmedel, antibiotika, och cycloplegics följt av antiinflammatoriska medel (t.ex., steroider) en gång hornhinnan har åter epithelialized^{1 ,2}. Trots de bästa nuvarande terapeutiska behandlingsalternativ tillgängliga är långsiktiga prognosen allmänt dåliga på grund av progressiva korneal grumling och kärlnybildning^2,3.

Djurmodeller har traditionellt använts för att undersöka kemiska toxicitet och förstå mekanismer för skada. Djurstudier är dock tidskrävande och dyrt. Det finns också insatser för att minska djurförsök. REACH-lagstiftningen (EG 1907/2006) i Europeiska unionen har till exempel bestämmelser avsedda att minska djurförsök. Bestämmelserna omfatta ett krav att företag dela data för att undvika animaliskt testning och godkännande från Europeiska kemikaliemyndigheten före utföra föreslagna tester på djur. Enligt bestämmelserna i REACH, bör djurförsök vara en sista utväg. Det finns också Europeiska kosmetikaförordningen (EG 1223/2009) att fasas ut provning av kosmetika på djur. När djurförsök genomförs, de styrs av principerna om 3R (förfining, minskning och byte), som ger en ram för utför humanare djurförsök, att minska antalet djur som används och använda alternativ till djurförsök där så är möjligt. Av dessa skäl har inom toxikologi velat anta in vitro- analyser som kan ge insikt i molekylära mekanismer för toxicitet och kan göras i högre genomströmning⁴. Detta är en funktionell toxikologi strategi där gifter definieras av deras funktion snarare än enbart av deras kemi. Tagit ett steg längre, funktionella toxikogenomik försöker förstå de roller som specifika gener spelar i effekterna av gifter⁵. Med tillämpning av siRNA teknik, kan skärmar att undersöka geners funktion i de molekylära och cellulära svar på gifter göras med högt dataflöde. siRNA är dubbel stranded RNA-molekyler som är 19-25 nukleotider långa som utnyttja post transkriptionell gen tysta vägen i alla däggdjursceller⁶. Dessa är syntetiskt gjort och utformade för att rikta en specifik gen. När införs i en cell, siRNA bearbetas och en strand, guide strand, läses in i RNA-inducerad ljuddämpningssystemet komplexet (RISC). SiRNA leder RISC till en kompletterande region i en mRNA-molekyl, och RISC försämrar mRNA. Detta resulterar i en minskning av uttryck av specifika genen. Den resulterande minskningen av uttryck av specifika genen kan sedan studeras i toxiska exponerade cellerna att kontrollera funktionen av denna gen den cellulära svar på den för människor. Ett sådant tillvägagångssätt har använts för att ytterligare förstå mekanismerna i ricin känslighet och AHR-beroende framkallande av CYP1A1^7,8.

Listan kemisk Terrorism Risk bedömning (CTRA) och toxiska industrikemikalier (TIC) listor har specificerade Välj kemikalier baserat på deras toxicitet och potential att släppas under en terrorist, krigföring, eller industriolycka händelse⁹. Vi tillämpar en siRNA hög genomströmning screening (HTS) toxikogenomiska inställning till studien av CTRA lista gifter, som identifierats vara hög risk för användning i en terrorist incident. Traditionella toxikologi syftar till att förstå de negativa effekter som kemikalier har på levande organismer. Vi har dock en ytterligare önskan att förstå mekanismerna bakom skadan för att informera utvecklingen av läkemedel och terapier, och eventuellt att upptäcka molekyler som kan inriktas för terapeutisk utveckling. Denna insats på något sätt kan anses jämförbar med användning av hög genomströmning siRNA screening och cellbaserade analyser i drug discovery process¹⁰. En stor skillnad skulle vara att läkemedelsutveckling syftar vanligtvis ett singular mål för terapeutiska upptäckt i vår strategi är det något osannolikt att det skulle finnas ett singular mål med högt terapeutiskt värde för behandling av toxiska exponering. Vi räknar med att någon effektiv behandling paradigm för toxiska exponering skulle kräva en mångfacetterad strategi att uppnå höga terapeutiska värde, och toxikogenomiska data kan oerhört informera en effektiv behandling-paradigm.

Bänkmonterade automation tar hög genomströmning metodik till laboratorier utanför i farmaceutiska eller biotech industri. In vitro- studier vid våra institute har historiskt traditionella analyser som är låg genomströmning^11,12,13. I de senaste åren, har vårt laboratorium övergått till användningen av bänkmonterade robotics att utföra hög genomströmning siRNA screening. Häri, presenterar vi förfining av okulär cellmodeller och utvecklingen av in vitro- exponering metoder för vätefluorid (HF) och klorpikrin (CP) lämpar sig för hög genomströmning siRNA screening. Vårt mål är att identifiera molekyler som reglerar cellulär skada som svar på dessa gifter. Målen i siRNA biblioteket vi valt inkluderar G-proteinkopplade receptorer, proteinkinaser, proteaser, fosfataser, jonkanaler och andra potentiellt druggable mål. HF och CP valdes ut för studien av korsreferenser CTRA lista agenter med ToxNet rapporter av industriolyckor att hitta de som medför störst risk för okulär skada via vapor exponering^9,14. CP (kemisk formel Cl₃CNO₂, CAS-nummer 76-06-2) användes ursprungligen som en tårgas i WWI¹⁵. Det används för närvarande som en jordbruks fumigant och funktioner som en nematicid, fungicid och insektsmedel¹⁶. Vätefluorid (HF) används i processer inklusive alkylering i oljeraffinaderier och elektrokemiska fluorination organiska föreningar¹⁷. HF (kemisk formel HF, CAS-nummer 62778-11-4) är en gas men i dess vattenhaltiga form är fluorvätesyra (HFA, CAS nummer 7664-39-3). Därför valde vi att använda HFA i vår i cell exponering modeller. SV40 stora T antigenet förevigade mänsklig korneal epitelial cell linje SV40-HCEC valdes ut för studien. Cellernas viabilitet och inflammatorisk markör IL-8 valdes som slutpunkter eftersom mål som är involverade i cellulär skada bör återspeglas i celldöd och det inflammatoriska svaret. Specifikt, om ett mål var en skyddande roll i toxiska exponering, bör celldöd och/eller inflammatorisk cytokin produktion öka när målet uttrycket hämmas av siRNA. Motsatsen skulle vara sant för mål som en negativ roll. Också, kronisk inflammation tycks spela en roll i hornhinnan patologi efter exponering och ingripande i cell death vägar kan förbättra kliniskt utfall^2,18.

Protocol

1. cell kultur underhåll Växer cellinje SV40-HCEC vid 37 ° C, 5% CO2och 90% luftfuktighet i DMEM F-12 med 15% fetalt bovint serum (FBS), 1% L-glutamin, 10 µg/L epidermal tillväxtfaktor (EGF) och 5 mg/L insulin. Passage av cellinje var 3 till 4 dagar (beroende på sådd densitet) för att säkerställa att konfluens aldrig överskrider 80% under kultur underhåll. Lossa cellerna från kolvar med en avlossning lösning (14 mL lösning för varje 150 cm2 kolv) och ink…

Representative Results

Exponering metodutveckling Vi raffinerade och utvärderas lämpligheten av raden mänsklig korneal epitelial cell SV40-HCEC för användning i HTS studier. SV40-HCEC var förevigade med hjälp av SV-40 stora T antigenet och var en gåva från Dhanajay Pal23. Det fanns alltför många variabler utforskas i exponering metodutveckling att presentera koncist häri, och så, bara några prover…

Discussion

Detta dokument beskriver vi våra metoder och resultat på utvecklingen av en hög genomströmning hornhinnan epitelial cell screening modell för studier av HF och CP skador. Vi presenterar också resultaten från den primära siRNA skärmen för HF skada. Det fanns många utmaningar för utvecklingen av HTS modeller för studien av TIC skador. Metoder som vi kunde hitta i litteraturen relaterade till studien av HF, HFA eller CP i cell kultur modeller var till lite hjälp. Flertalet in vitro- studier på fluor …

Materials

Bravo liquid handing platform	Agilent or equivalent	G5409A
Bravo plate shaker	Agilent or equivalent	Option 159
Bravo 96LT disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 178	96-channel large tip pipetting head unit
Bravo 96ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 177	96-channel small tip pipetting head unit
Bravo 384ST disposable tip head	Agilent or equivalent	Option 179	384-channel small tip pipetting head unit
Bravo 96 250 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19477-022
Bravo 384 30 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
Bravo 384 70 μL sterile barrier tips	Agilent or equivalent	19133-212
EnSpire multimode plate reader	Perkin Elmer or equivalent	2300-0000	AlphaLISA assay detector with high power laser excitation
IL-8 (human) AlphaLISA Detection Kit	Perkin Elmer or equivalent	AL224F	no-wash bead-based assay
ProxiPlate-384 Plus white 384-shallow well microplates	Perkin Elmer or equivalent	6008359
Lipofectamine RNAiMAX	Invitrogen or equivalent	13778500	Transfection reagent
Opti-MEM 1 Reduced Serum Medium	Invitrogen or equivalent	31985070
TrypLE Express	Gibco or equivalent	12605010	Cell detachment solution
IncuCyte Zoom	Essen Instruments or equivalent	ESSEN BIOSCI 4473	Incubator-housed automated microscope
Chloropicrin	Trinity Manufacturing or equivalent	N/A	Acute toxicity and irritant
DMEM-F12 cell culture medium	Invitrogen or equivalent	11330-057	Contains HEPES
Fetal bovine serum	Invitrogen or equivalent	1891471
Human epidermal growth factor (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	E9644-.2MG
Recombinant human insulin (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	12585-014
Penicillin-Streptomycin solution (cell culture grade)	Invitrogen or equivalent	15140122
Hydrocortisone (cell culture grade)	Sigma or equivalent	H0888-10G
Glucose  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	G7021
PBS  (cell culture grade)	Sigma or equivalent	P5493
siRNA	Dharmacon or equivalent	various
Thiazolyl blue tetrazolium bromide	Sigma or equivalent	M5655	MTT assay substrate
siRNA buffer	Thermo or equivalent	B002000
96-well cell culture plates	Corning or equivalent	CLS3595
T150 cell culture flasks	Corning or equivalent	CLS430825
BSL-2 cell culture hood	Nuaire or equivalent	NU-540
300 mL robotic reservoirs	Thermo or equivalent	12-565-572
96 baffled automation reservoirs	Thermo or equivalent	1064-15-8
500 mL sterile disposable storage bottles	Corning or equivalent	CLS430282
Microplate heat sealer	Thermo or equivalent	AB-1443A
Microplate heat sealing foil	Thermo or equivalent	AB-0475
Cardamonin	Tocris or equivalent	2509	Anti-inflammatory, used as positive control
SKF 86002	Tocris or equivalent	2008	Anti-inflammatory, used as positive control
DMSO	Sigma or equivalent	D8418
48% hydrofluoric acid	Sigma or equivalent	339261	Corrosive and acute toxicity
1000 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014382
200 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014391
20 μL Single channel pipettors	Rainin or equivalent	17014392
1000 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17014497
200 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013810
20 μL 12-channel pipettors	Rainin or equivalent	17013808
Pipettor tips 1000 μL	Rainin or equivalent	17002920
Pipettor tips 200 μL	Rainin or equivalent	17014294
Pipettor tips 20 μL	Rainin or equivalent	17002928
Chemical fume hood	Jamestown Metal Products	MHCO_229
384-well sample storage plates	Thermo or equivalent	262261
Sodium chloride	Sigma or equivalent	S6191
50 mL conical tubes	Thermo or equivalent	14-959-49A
Serological pipettes 50 mL	Corning or equivalent	07-200-576
Serological pipettes 25 mL	Corning or equivalent	07-200-575
Serological pipettes 10 mL	Corning or equivalent	07-200-574
Serological pipettes 5 mL	Corning or equivalent	07-200-573
SV40-HCEC immortalized human corneal epithelial cells	N/A	N/A	These cells are not commercially available, but can be obtained from the investigators cited in the article
Sceptor Handheld Automated Cell Counter	Millipore or equivalent	PHCC20060
GeneTitan Multi-Channel (MC) Instrument	Affymetrix or equivalent	00-0372
Affymetrix 24- and 96-array plates	Affymetrix or equivalent	901257; 901434
Draegger tube HF	Draeger or equivalent	8103251
Draegger tube CP	Draeger or equivalent	8103421
Draegger pump	Draeger or equivalent	6400000
Clear Plate seals	Resesarch Products International or Equivalent	202502
Reagent reservoirs	VistaLab Technologies or equivalent	3054-1000
Xlfit	IDBS or equivalent	N/A	Excel add-in used for automated curve fitting