Fabricage van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie Array
Summary
Dit artikel beschrijft de gedetailleerde methodologie ter voorbereiding van een Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME)-array voor high-throughput manipulatie van fysische en chemische cues nabootsen in vivo cellulaire microenvironments en aan het identificeren van de optimale cellulaire omgeving voor menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs) met eencellige profilering.
Abstract
Cellulaire microenvironments bestaan uit een aantal signalen, zoals groeifactoren, extracellulaire matrices en intercellulaire interacties. Deze signalen zijn goed georkestreerd en cruciaal bij het reguleren van de functies van de cel in een levend systeem. Hoewel een aantal onderzoekers hebben geprobeerd te onderzoeken van de correlatie tussen milieufactoren en gewenste cellulaire functies, er nog veel onbekend. Dit is grotendeels te wijten aan het ontbreken van een juiste methodologie te bootsen zo’n milieu signalen in vitro, gelijktijdig testen met verschillende milieu aanwijzingen op cellen. Wij rapporteren hier, een geïntegreerd platform van microfluidic kanalen en een array van de nanofiber, gevolgd door hoge-eencellige inhoudsanalyse, te onderzoeken van de stamcel fenotypen gewijzigd door verschillende omgevingsfactoren. Om aan te tonen van de toepassing van dit platform, deze studie concentreert zich op de fenotypen van zelf vernieuwen van menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs). Hier presenteren we de procedures van de voorbereiding voor een matrix van de nanofiber en de microfluidic-structuur in de fabricage van een array Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME). Bovendien de algemene stappen voor de eencellige profiling, cel kleuring met meerdere fluorescente markeringen, meerdere fluorescentie imaging en statistische analyses, worden beschreven.
Introduction
Menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)1,2 zelf vernieuwen onbeperkt en onderscheid in verschillende geslachten van weefsel, die kunnen een revolutie Geneesmiddelenontwikkeling, cel-gebaseerde therapieën, weefselkweek en regeneratieve geneeskunde 3 , 4 , 5 , 6. algemene cultuur gerechten en microtiterplaat platen, echter zijn niet ontworpen om precieze cel van de fysische en chemische manipulatie op cellulair niveau met het bereik van nano – tot micro-meters, die een kritische factor voor cellulaire expansie is, zelf-vernieuwing en differentiatie. Om aan te pakken dit nadeel, hebben studies onderzocht de rol van cellulaire microenvironments bij het reguleren van de cel-lot besluiten en cel functies4. In de afgelopen jaren zijn een toenemend aantal studies uitgevoerd om te reconstrueren van cellulaire microenvironments in vitro7,8. Nano – en micro-fabricage processen hebben deze microenvironments door de manipulatie van chemische9,10,11,12,13, vastgesteld 14,,15,16,17 en fysieke18,19,20 milieu signalen. Tot nu toe waren er geen meldingen te systematisch onderzoeken van de onderliggende mechanismen van chemische en fysische milieu signalen op cel-lot besluiten en functies binnen een enkel platform.
Hier introduceren we een strategie gebaseerd op eenvoudig ontwerpprincipes om een robuuste screening platform (Figuur 1). Eerst beschrijven we de procedure van de ontwikkeling van een geïntegreerd platform voor het maken van de veelzijdige, kunstmatige cellulaire microenvironments met behulp van een nanofiber array en een microfluidic structuur: de Multiplexed kunstmatige cellulaire communicatie (MACME) matrix (Figuur 1A pt 2A). De nanofiber array heeft 12 verschillende microenvironments in wisselende combinaties van nanofiber materialen en dichtheden. Electrospinning werd gebruikt om nanofibers te fabriceren. De nanofiber materialen, zoals polystyreen (PS)21, polymethylglutarimide (PMGI)22en gelatine (GT)23, werden ontworpen voor het testen van hun chemische eigenschappen, die later nog van invloed kunnen zijn op cel adhesie en het onderhoud van pluripotent ( Figuur 2B). Nanofiber dichtheden waren gevarieerd door het veranderen van electrospinning tijd en de geproduceerde nanofibers werden gedefinieerd volgens hun dichtheid (niet gefinisht, met D = XLow/Low/Mid/High). De microfluidic structuur bestaat uit Polydimethylsiloxaan (PDMS) 48 celkweek kamers, die kunnen worden geplaatst langs de standaard afmetingen van de 96-Wells-microplate herbergen. PDMS is een biocompatibel en gas-inwisselbaar polymeer gewoonlijk gebruikt voor het fabriceren van microfluidic apparaten24. Elk kanaal van de microfluidic werd ontworpen om 700-µm breed en 8.4-mm lang en had twee inhammen aan de randen (tabel 1). De kamers hadden verschillende hoogtes (250, 500 en 1000 µm) te manipuleren van de eerste cel-zaaien dichtheden (0.3 en 0.6 1,2 × 105 cellen/cm2), die met overleven, proliferatie en differentiatie van hPSCs25 correleren kunnen (Figuur 2C). Het aantal cellen zaadjes in een kamer is evenredig met de dichtheid van de kolom boven de vloer van de kamer, en dus de eerste cel zaaien dichtheid werd gecontroleerd door de invoering van de dezelfde celsuspensie in cultuur kamers met verschillende hoogtes. Alle zenders werden ontworpen om ≥ 250-µm hoge26 om te minimaliseren van de effecten van lage-zuurstof-spanning27 en schuifspanning28 op de cellen. Kanaal hoogten van 250, 500 en 1000 µm hier hierna afgekort als XCD met X = Low, Mid, en hoog, respectievelijk. De omgevingen met verschillende nanofiber dichtheden en eerste cel-zaaien dichtheden waren afgekort als “Material_NF density_Cell dichtheid” (bijvoorbeeld, GT_HighNF_HighCD: een milieu gekenmerkt door high-density GT nanofibers en hoge initiële cel-zaaien dichtheid).
Vervolgens beschrijven we hoe eencellige analyses voor het systematisch onderzoek naar cel gedrag in reactie op milieu-factoren (Figuur 1B) uitvoeren. Als een bewijs-van-concept geïdentificeerd we de optimale cellulaire omgeving voor hPSC zelf-vernieuwing, dat is een belangrijke functie voor hPSC onderhoud (Figuur 1B)29. Beeld-gebaseerde cytometry, gevolgd door statistische analyses, zorgt voor kwantitatieve interpretatie van individuele cellulaire fenotypische reacties op cellulaire omgevingen. Onder een verscheidenheid van cellulaire functies biedt dit Witboek een gedetailleerde procedure ter identificatie van de optimale voorwaarden voor het behoud van hPSC zelf-vernieuwing.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol wordt de eerste screeningsmethode om een systeem van de robuuste cultuur voor het onderhoud van gekwalificeerde hPSCs gedemonstreerd. Eerst, beschreven we hoe voor te bereiden op een platform met gevarieerde kunstmatige ECMs en cel dichtheden zaaien met behulp van een microfluidic apparaat geïntegreerd met een nanofiber-serie, de MACME array. Tweede, kwantitatieve beeld-gebaseerde eencellige fenotypering was uitgevoerd50 individuele cellulaire resultaten en gedrag veranderd door vers…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We bedanken Prof. N. Nakatsuji op iCeMS, de Universiteit van Kyoto, voor het verstrekken van menselijke ES-cellen. Wij danken ook Prof. A. Maruyama aan Tokyo Institute of Technology voor zijn ondersteuning bij het gebruik van de atomaire kracht Microscoop. Financiering was gulle wijze aangeboden door de vereniging van Japan voor de promotie van wetenschap (JSPS; 22350104, 23681028, 25886006 en 24656502); financiering werd ook verstrekt door de nieuwe energie en industriële technologie ontwikkeling organisatie (NEDO) en de Terumo Life Science Foundation. De WPI-iCeMS wordt ondersteund door de World Premier International Research Centrum initiatief (WPI), het ministerie van onderwijs, cultuur, sport, wetenschap en technologie (MEXT), Japan. Een deel van dit werk werd gesteund door de Kyoto Universiteit nanotechnologie Hub en het AIST Nano-Processing Facility in “Nanotechnologie Platform Project” gesponsord door MEXT, Japan.
Materials
| Polystyrene (PS) | Sigma | #182435 | Average Mw: 290,000, average Mn: 130,000 |
| Polymethylglutarimide (PMGI) | MicroChem | G113113 | |
| Gelatin (GT) | Sigma | G2625 | From porcine skin, type A |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Doe Corning Toray | #1064291 | PDMS curing agent and silicone elastomer base are components of this kit. |
| OpenSCAD | This is a free 3D computer graphics software (http://www.openscad.org/) used for designing the mold of the microfluidic device. | ||
| AutoCAD 2014 | Autodesk | This is a 3D computer graphics software (https://www.autodesk.com/products/autocad/overview) used for design of the mask used on nanofiber-array preparation. | |
| 3D printer, AGILISTA-3000 | Keyence | ||
| UV-curable resin, AR-M2 | Keyence | This is used for 3D printing by Agilista. | |
| Acetic acid | Sigma | #338826 | ≥99.99% |
| Ethyl acetate | Sigma | #270989 | Anhydrous, 99.8% |
| Tetrahydrofuran (THF) | Sigma | #401757 | |
| MSP-30T | Vacuum Device | Magnetron sputtering machine | |
| Nunc OmniTray | Thermo Fisher Scientific | #242811 | This is a polystyrene baseplate on which the nanofiber array is created. This plate size is typically 127.7 x 85.5 mm. |
| Gun-type corona discharge machine | Shinko Electric & Instrumentation | CFG-500 | This handy device is used to generate corona for activation of the bottom surface of the PDMS layer at step 1.5 "Assembly of the MACME arrays" in the protocol. |
| 5 mL syringe | Terumo | SS-05SZ | |
| Stainless-steel blunt needle (23-gauge) | Nipro | #2166 | Outside diameter and length are 0.6 and 32 mm, respectively. |
| High-voltage power supply | TechDempaz | ||
| 1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide, hydrochloride | Dojindo | W001 | |
| N-Hydroxysuccinimide | Sigma | #56480 | |
| Matrigel hESC-Qualified Matrix | Corning | #354277 | This protein is refered as basement membrane gel matrix in the protocol. |
| CellAdhere Vitronectin, Human, Solution | STEMCELL Technologies | #07004 | |
| TeSR-E8 | STEMCELL Technologies | #05940 | Feeder-free, xeno-free culture medium for maintenance of human ES and iPS cells |
| Y-27632 | Wako Pure Chemical Industries | #253-00513 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | #12605028 | This ia a recombinant trypsin-like protease for dissociation of adherant mammalian cells. |
| Click-iT EdU Imaging Kit with Alexa Fluor 647 Azides | Thermo Fisher Scientific | C10086 | The fluorescent labeling of proliferating cells in on-plate fluorescent staining was performed along the product manual of this kit. |
| Annexin V, Alexa Fluor 594 conjugate | Thermo Fisher Scientific | A13203 | |
| 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| Oct-3/4 Antibody (C-10) | Santa Cruz Biotechnology | sc-5279 | |
| Donkey Anti-Mouse IgG H&L (DyLight 488) | abcam | ab96875 | This is a secondary antibody used in on-plate fluorescent cell staining. |
| ECLIPSE Ti-E | Nikon | This is an inverted fluorescence microscope equipped with a CFI Plan Fluor 4×/0.13 N.A. objective lens (Nikon), CCD camera (ORCA-R2, Hamamatsu), mercury lamp (Intensilight, Nikon), XYZ automated stage (Ti-S-ER motorized stage with encoders, Nikon), and filter cubes for four fluorescence channels (DAPI, GFP HYQ, TRITC, Cy5; Nikon) | |
| NIS-Elements Advanced Research | Nikon | This is a microscope imaging software used for automatic image acquisition. | |
| CellProfiler, Version 2.1.0 | This is a free open software for cell image analysis (http://cellprofiler.org/). | ||
| R | SOM analysis is performed by kohonen package of this software. This is freely available (https://www.r-project.org/). | ||
| Cluster 3.0 | This is the open source clustering software (http://bonsai.hgc.jp/~mdehoon/software/cluster/software.htm). Unsupervised hierarchical clustering is performed with this software. | ||
| Java TreeView | This open source software (http://jtreeview.sourceforge.net/) is used to visualize clustering data as a heatmap and a dendrogram. | ||
| H9 human embryonic stem cell | WiCell Stem Cell Bank | WA09 |
Referências
- Thomson, J. A., et al. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts. Science. 282 (5391), 1145-1147 (1998).
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Ameen, C., et al. Human embryonic stem cells: Current technologies and emerging industrial applications. Crit Rev Oncol Hematol. 65 (1), 54-80 (2008).
- Nishikawa, S., Goldstein, R. A., Nierras, C. R. The promise of human induced pluripotent stem cells for research and therapy. Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (9), 725-729 (2008).
- Robinton, D. A., Daley, G. Q. The promise of induced pluripotent stem cells in research and therapy. Nature. 481 (7381), 295-305 (2012).
- Sartipy, P., Bjorquist, P., Strehl, R., Hyllner, J. The application of human embryonic stem cell technologies to drug discovery. Drug Discovery Today. 12 (17-18), 688-699 (2007).
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth factors, matrices, and forces combine and control stem cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9 (4), 239-252 (2009).
- Danhier, F., Feron, O., Preat, V. To exploit the tumor microenvironment: Passive and active tumor targeting of nanocarriers for anti-cancer drug delivery. J Control Release. 148 (2), 135-146 (2010).
- Murphy, W. L., McDevitt, T. C., Engler, A. J. Materials as stem cell regulators. Nat Mater. 13 (6), 547-557 (2014).
- Patel, A. K., et al. A defined synthetic substrate for serum-free culture of human stem cell derived cardiomyocytes with improved functional maturity identified using combinatorial materials microarrays. Biomaterials. 61, 257-265 (2015).
- Zhang, R., et al. A thermoresponsive and chemically defined hydrogel for long-term culture of human embryonic stem cells. Nat Commun. 4, (2013).
- Anderson, D. G., Putnam, D., Lavik, E. B., Mahmood, T. A., Langer, R. Biomaterial microarrays: rapid, microscale screening of polymer-cell interaction. Biomaterials. 26 (23), 4892-4897 (2005).
- Celiz, A. D., et al. Discovery of a Novel Polymer for Human Pluripotent Stem Cell Expansion and Multilineage Differentiation. Adv Mater. 27 (27), 4006-4012 (2015).
- Hansen, A., et al. High-Density Polymer Microarrays: Identifying Synthetic Polymers that Control Human Embryonic Stem Cell Growth. Adv Healthcare Mater. 3 (6), 848-853 (2014).
- Mei, Y., et al. A high throughput micro-array system of polymer surfaces for the manipulation of primary pancreatic islet cells. Biomaterials. 31 (34), 8989-8995 (2010).
- Saha, K., et al. Surface-engineered substrates for improved human pluripotent stem cell culture under fully defined conditions. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (46), 18714-18719 (2011).
- Bettinger, C. J., Langer, R., Borenstein, J. T. Engineering substrate topography at the micro- and nanoscale to control cell function. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (30), 5406-5415 (2009).
- McMurray, R. J., et al. Nanoscale surfaces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater. 10 (8), 637-644 (2011).
- Sun, Y., Jallerat, Q., Szymanski, J. M., Feinberg, A. W. Conformal nanopatterning of extracellular matrix proteins onto topographically complex surfaces. Nat Methods. 12 (2), 134-136 (2015).
- Nitanan, T., et al. Effects of processing parameters on morphology of electrospun polystyrene nanofibers. Korean J Chem Eng. 29 (2), 173-181 (2012).
- Liu, L., et al. Chemically-defined scaffolds created with electrospun synthetic nanofibers to maintain mouse embryonic stem cell culture under feeder-free conditions. Biotechnol Lett. 34 (10), 1951-1957 (2012).
- Liu, L., et al. Nanofibrous gelatin substrates for long-term expansion of human pluripotent stem cells. Biomaterials. 35 (24), 6259-6267 (2014).
- Kamei, K., et al. Phenotypic and transcriptional modulation of human pluripotent stem cells induced by nano/microfabrication materials. Adv Healthcare Mater. 2 (2), 287-291 (2013).
- Peerani, R., et al. Niche-mediated control of human embryonic stem cell self-renewal and differentiation. EMBO J. 26 (22), 4744-4755 (2007).
- Yamamoto, K., et al. Fluid shear stress induces differentiation of Flk-1-positive embryonic stem cells into vascular endothelial cells in vitro. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 288 (4), 1915-1924 (2005).
- Charati, S. G., Stern, S. A. Diffusion of gases in silicone polymers: Molecular dynamics simulations. Macromolecules. 31 (16), 5529-5535 (1998).
- Prado-Lopez, S., et al. Hypoxia promotes efficient differentiation of human embryonic stem cells to functional endothelium. Stem Cells. 28 (3), 407-418 (2010).
- Yanagihara, K., et al. Prediction of Differentiation Tendency Toward Hepatocytes from Gene Expression in Undifferentiated Human Pluripotent Stem Cells. Stem Cells and Development. 25 (24), 1884-1897 (2016).
- Kamei, K., et al. 3D printing of soft lithography mold for rapid production of polydimethylsiloxane-based microfluidic devices for cell stimulation with concentration gradients. Biomed Microdevices. 17 (2), (2015).
- Song, J. H., Kim, H. E., Kim, H. W. Production of electrospun gelatin nanofiber by water-based co-solvent approach. J Mater Sci Mater Med. 19 (1), 95-102 (2008).
- Owen, M. J., Smith, P. J. Plasma Treatment of Polydimethylsiloxane. J Adhes Sci Technol. 8 (10), 1063-1075 (1994).
- Chen, G. K., et al. Chemically defined conditions for human iPSC derivation and culture. Nat Methods. 8 (5), 424-476 (2011).
- Watanabe, K., et al. A ROCK inhibitor permits survival of dissociated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25 (6), 681-686 (2007).
- Kamei, K., et al. An integrated microfluidic culture device for quantitative analysis of human embryonic stem cells. Lab Chip. 9 (4), 555-563 (2009).
- Kamei, K., et al. Microfluidic image cytometry for quantitative single-cell profiling of human pluripotent stem cells in chemically defined conditions. Lab Chip. 10 (9), 1113-1119 (2010).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), 100 (2006).
- Kohonen, T. Self-Organized Formation of Topologically Correct Feature Maps. Biol Cybern. 43 (1), 59-69 (1982).
- Wehrens, R., Buydens, L. M. C. Self- and super-organizing maps in R: The kohonen package. J Stat Softw. 21 (5), 1-19 (2007).
- Eisen, M. B., Spellman, P. T., Brown, P. O., Botstein, D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (25), 14863-14868 (1998).
- Saldanha, A. J. Java Treeview–extensible visualization of microarray data. Bioinformatics. 20 (17), 3246-3248 (2004).
- Du, G. S., Fang, Q., den Toonder, J. M. J. Microfluidics for cell-based high throughput screening platformsd-A review. Anal Chim Acta. 903, 36-50 (2016).
- Huang, S. B., et al. An integrated microfluidic cell culture system for high-throughput perfusion three-dimensional cell culture-based assays: effect of cell culture model on the results of chemosensitivity assays dagger. Lab Chip. 13 (6), 1133-1143 (2013).
- Wang, B. L., et al. Microfluidic high-throughput culturing of single cells for selection based on extracellular metabolite production or consumption. Nat Biotechnol. 32 (5), 473 (2014).
- Becker, K. A., et al. Self-renewal of human embryonic stem cells is supported by a shortened G1 cell cycle phase. J Cell Physiol. 209 (3), 883-893 (2006).
- Neganova, I., Lako, M. G1 to S phase cell cycle transition in somatic and embryonic stem cells. J Anat. 213 (1), 30-44 (2008).
- Fox, V., et al. Cell-cell signaling through NOTCH regulates human embryonic stem cell proliferation. Stem Cells. 26 (3), 715-723 (2008).
- Xu, C., et al. Feeder-free growth of undifferentiated human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 19 (10), 971-974 (2001).
- Kamei, K., et al. Microfluidic-Nanofiber Hybrid Array for Screening of Cellular Microenvironments. Small. 13 (18), (2017).
- Sun, J., et al. A Microfluidic Platform for Systems Pathology: Multiparameter Single-Cell Signaling Measurements of Clinical Brain Tumor Specimens. Cancer Res. 70 (15), 6128-6138 (2010).
- Theunissen, T. W., Jaenisch, R. Molecular Control of Induced Pluripotency. Cell Stem Cell. 14 (6), 720-734 (2014).
- Yoo, H. S., Kim, T. G., Park, T. G. Surface-functionalized electrospun nanofibers for tissue engineering and drug delivery. Adv Drug Del Rev. 61 (12), 1033-1042 (2009).
- Dixon, J. E., et al. Combined hydrogels that switch human pluripotent stem cells from self-renewal to differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (15), 5580-5585 (2014).
