आरएनए Pull-डाउन प्रक्रिया एक लंबी गैर-कोडिंग आरएनए के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए

Summary

यह शाही सेना पुल-डाउन विधि एक लंबे समय से गैर कोडिंग आरएनए (lncRNA) के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने की अनुमति देता है । घर के संकरण के आधार पर बनाया, डिजाइन विरोधी भावना डीएनए oligonucleotide जांच एक उचित निश्चित ऊतक या सेल लाइन में इस lncRNA के लिए विशिष्ट, यह कुशलतापूर्वक lncRNA के सभी आरएनए लक्ष्यों पर कब्जा करने की अनुमति देता है ।

Abstract

लंबी गैर-कोडिंग आरएनए (lncRNA), जो एक निर्धारित पठन फ़्रेम के बिना 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम हैं, विनियामक गैर-कोडिंग आरएनए के परिवार से संबंधित हैं । हालांकि उनके जैविक कार्य मोटे तौर पर अज्ञात रहते हैं, लेकिन इन lncRNAs की संख्या में लगातार वृद्धि हुई है और अब यह अनुमान है कि मनुष्यों में 10,000 से अधिक ऐसे टेप हो सकते हैं । इनमें से कुछ के लिए जीन अभिव्यक्ति जो transcriptional स्तर पर जगह ले के महत्वपूर्ण नियामक रास्ते में शामिल होने के लिए जाना जाता है, लेकिन यह भी आरएनए सह और बाद के विभिंन चरणों में transcriptional परिपक्वता । उत्तरार्द्ध मामलों में, RNAs कि lncRNA द्वारा लक्षित कर रहे है की पहचान की है । यही कारण है कि यह एक lncRNA ब्याज के साथ प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से जुड़े RNAs की पहचान को सक्षम करने के लिए एक विधि विकसित करने के लिए उपयोगी है ।

इस प्रोटोकॉल, जो पहले प्रकाशित एक lncRNA के अलगाव की अनुमति अपने संबद्ध क्रोमेटिन दृश्यों के साथ एक साथ प्रोटोकॉल से प्रेरित था, के लिए संबद्ध RNAs के अलगाव की अनुमति अनुकूलित था । हम निर्धारित किया है कि दो कदम इस प्रोटोकॉल की क्षमता के लिए महत्वपूर्ण हैं । पहले विशिष्ट विरोधी नब्ज डीएनए oligonucleotide जांच के डिजाइन के लिए ब्याज की lncRNA को संकरण कर रहा है । इस अंत करने के लिए, lncRNA माध्यमिक संरचना bioinformatics और विरोधी भावना oligonucleotide जांच द्वारा भविष्यवाणी की थी क्षेत्रों है कि आंतरिक आधार बाँधना की एक कम संभावना प्रदर्शित करने के लिए एक मजबूत संबंध के साथ डिजाइन किए गए थे । प्रक्रिया का दूसरा महत्वपूर्ण कदम ऊतक या संस्कृति कोशिकाओं है कि सभी आणविक भागीदारों के बीच नेटवर्क का संरक्षण किया है की निर्धारण की स्थिति पर निर्भर करता है । उच्च प्रवाह आरएनए अनुक्रमण के साथ युग्मित, इस आरएनए पुल डाउन प्रोटोकॉल ब्याज की एक lncRNA की पूरी आरएनए interactome प्रदान कर सकते हैं.

Introduction

यहां वर्णित विधि के समग्र लक्ष्य के लिए एक लंबी डिकोडिंग आरएनए (lncRNA) के आरएनए आणविक भागीदारों की पहचान है । LncRNA एक निर्धारित पठन फ़्रेम के बिना 200 से अधिक न्यूक्लियोटाइड के अनुक्रम के अनुरूप है । उनमें से कुछ को जीन अभिव्यक्ति विनियमन में शामिल होना दिखाया गया है, न केवल transcriptional स्तर पर, लेकिन यह भी आरएनए सह के विभिंन चरणों में और transcriptional परिपक्वता के बाद । उत्तरार्द्ध मामलों में, lncRNA के आणविक भागीदारों RNAs कि पहचान करने के लिए कर रहे हैं । एक lncRNA हित के साथ प्रत्यक्ष या परोक्ष रूप से जुड़े RNAs की पहचान को सक्षम करने के लिए तो विकसित करने के लिए आवश्यक हो जाएगा ।

पहले से प्रकाशित विधियां, जैसे आरएनए शुद्धि द्वारा क्रोमेटिन अलगाव (कलरव)^1,2 और आरएनए के कब्जा संकरण विश्लेषण लक्ष्य (चार्ट)^3,4, के उच्च प्रवाह की खोज की अनुमति दें आरएनए-बाउंड प्रोटीन्स और एक विशिष्ट lncRNA की जीनोमिक बाइंडिंग साइटें । इन दो तरीकों में, ब्याज की lncRNA पहले biotinylated पूरक oligonucleotides के लिए संकरित किया गया था, और जटिल तो streptavidin मोतियों का उपयोग अलग था । इन दोनों तकनीकों के बीच मुख्य अंतर जांच के डिजाइन से संबंधित है कि लक्ष्य lncRNAs । कलरव, आरएनए मछली से प्रेरित रणनीति, lncRNA की पूरी लंबाई टाइल करने के लिए लघु पूरक डीएनए oligonucleotide जांच के एक पूल डिजाइनिंग के शामिल थे । इसके विपरीत, चार्ट में, लेखक lncRNAs पर एक RNase एच मानचित्रण परख संकरण के लिए उपलब्ध साइटों की जांच करने के लिए अनुकूलित ।

प्रक्रिया विरोधी नब्ज डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए यहां प्रस्तावित lncRNA माध्यमिक संरचना के bioinformatics मॉडलिंग का उपयोग करता है⁵ क्षेत्रों के लिए एक मजबूत समानता है कि आंतरिक की एक कम संभावना प्रदर्शित के साथ जांच का चयन करने के लिए आधार बाँधना. इस प्रक्रिया के टाइलिंग oligonucleotide जांच के पूल के आधार पर उन से कम महंगा होने का फायदा है² और कम समय लेने वालों की तुलना में RNAse-एच संवेदनशीलता⁴पर आधारित है ।

के रूप में वहां के बाद के लिए सबूत के एक बढ़ती शरीर है transcriptional जीन विनियमन lncRNAs द्वारा⁶, यह बहुत ही एक lncRNA के लक्ष्य है कि RNAs के कब्जा को सक्षम करने के दृष्टिकोण को विकसित करने के लिए उपयोगी है । इसके अलावा, सबसे अनुप्रयोगों के लिए प्रयोग करने योग्य हो, दृष्टिकोण दोनों प्रसंस्कृत कोशिकाओं और ऊतक निष्कर्षों में अनुकूलित किया गया था ।

Protocol

सभी प्रक्रियाओं की देखभाल और प्रयोगशाला पशुओं के उपयोग के लिए यूरोपीय आर्थिक समुदाय के साथ सख्त अनुसार प्रदर्शन किया गया (86/609/EEC और 2010/63/यत) और एक Becquet को दी लाइसेंस के तहत (प्रीफेक्चर des Bouches-du-Rhône, प्राधिकरण no. 13-002) । 1. जांच डिजाइन ब्याज की lncRNA के प्राथमिक अनुक्रम का प्रयोग, “RNAstructure वेब सर्वर”5पर अपने माध्यमिक संरचना उत्पंन करते हैं ।नोट: इस साइट पर, विभिन्न एल्गोरिदम इस्तेमाल किया जा सकता है. तीन भविष्यवाणी उपकरण है कि जांच डिजाइन के लिए सबसे अच्छा परिणाम दे रहे हैं: “गुना” (सबसे कम मुक्त ऊर्जा संरचना), “MaxExpect” (अत्यधिक संभावित आधार जोड़े), और “Probnot” (pseudoknots सहित संभावित आधार जोड़े) । इन तीन विश्लेषणों का प्रदर्शन और तुलना की जा सकती है. अंय वेब सर्वर, जैसे वियना आरएनए websuite7, भी किया जा सकता है । इन क्षेत्रों के लिए एक मजबूत संबंध के साथ 25 ठिकानों की आंतरिक आधार बाँधना और डिजाइन विरोधी भावना oligonucleotide जांच की एक कम संभावना प्रदर्शित क्षेत्रों का चयन करें ।नोट: इन जांच की जीसी सामग्री 40 और 60% के बीच शामिल किया जाना चाहिए । एक संरेखण खोज उपकरण (ब्लास्ट) का उपयोग करना, सुनिश्चित करें कि चयनित विरोधी भावना oligonucleotide जांच न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम अंय आरएनए चुना सेल प्रणाली में व्यक्त में पहचान नहीं है । डिजाइन भी 25 ठिकानों की एक गैर विशिष्ट डीएनए oligonucleotide जांच जो ब्याज की lncRNA के लिए न तो संबध प्रदर्शित करता है और न ही ब्याज के जीनोम में अंय आरएनए अनुक्रम के लिए । 3 ‘ अंत में बायोटिन के साथ जांच आदेश ।नोट: आदेश में steric बाधा को कम करने के लिए, oligonucleotide और बायोटिन के बीच की दूरी एक triethyleneglycerol स्पेसर के साथ वृद्धि की जानी है । एक इष्टतम परिणाम के लिए, और खींचने के परिणामों की विशिष्टता का आकलन करने में सक्षम होने के लिए नीचे, यह 3 अलग विरोधी भावना oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए सिफारिश की है और फिर प्रयोग करने के लिए अपनी कार्यकुशलता की तुलना । 2. पार से जोड़ने कल्चरल सेल को परस्पर जोड़ना संस्कृति GH4C1 sommatolactotroph है हैम F10 मध्यम में पिट्यूटरी कोशिकाओं 15% हार्स सीरम और 2% भ्रूण बछड़ा सीरम के साथ पूरक । ७८.५ cm2 कल्चर प्लेट्स में संगम तक कोशिकाओं को बढ़ाएं । यह लगभग 1 x 107 कक्षों से मेल खाती है । एक धाराप्रवाह GH4C1 ७८.५ cm2 संस्कृति प्लेट से सेल संस्कृति माध्यम निकालें, तो 1x के साथ कुल्ला फॉस्फेट के मध्यम मात्रा में बफर खारा (पंजाब) पंजाब में 1% paraformaldehyde समाधान के साथ कोशिकाओं को ठीक करें (एक ७८.५ cm2 व्यंजन के लिए 10 मिलीलीटर); यह समाधान एक 4% paraformaldehyde शेयर समाधान से हौसले से तैयार होना चाहिए । क्रॉस-कमरे के तापमान पर 10 मिनट के लिए आंदोलन के तहत लिंक (आरटी) ।चेतावनी: Paraformaldehyde (पीएफए) विषाक्त है, और सावधानी के साथ नियंत्रित किया जाना चाहिए । glycine 1.25 मीटर (paraformaldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर) की 1/10 मात्रा जोड़कर paraformaldehyde कार्रवाई बुझाने; आरटी पर आंदोलन 5 मिनट । आकांक्षा द्वारा मीडिया को त्यागें और दो बार कुल्ला (5 मिनट) 1x के साथ पंजाब के मध्यम मात्रा । मीडिया की मात्रा के 1/10 के लिए इसी पंजाब के एक खंड जोड़ें, एक सेल खुरचनी के साथ कोशिकाओं को इकट्ठा, और फिर एक केंद्रापसारक ट्यूब करने के लिए स्थानांतरण । 5 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 510 जी पर स्पिन । जितना हो सके उतना supernatant निकालें । स्टोर छर्रों अनिश्चित काल के रूप में-80 डिग्री सेल्सियस पर की जरूरत है । ऊतक पार से जोड़ने 1% के एक समाधान में हौसले से प्राप्त माउस पिट्यूटरी ग्रंथि ऊतक के 5 मिलीग्राम रखो paraformaldehyde (लगभग 10x ऊतक की मात्रा) में पतला है, 10 मिनट के लिए आरटी पर आंदोलन । एक 1.25 मीटर glycine समाधान (paraformaldehyde समाधान के 10 मिलीलीटर प्रति 1 मिलीलीटर) और आरटी पर 5 मिनट आंदोलन जोड़कर paraformaldehyde कार्रवाई बुझाने । आकांक्षा द्वारा मीडिया को त्यागें और पंजाबियों के साथ दो बार कुल्ला (लगभग 10x ऊतक की मात्रा) । जितना हो सके उतना supernatant निकालें । -80 ° c पर अनिश्चित रूप से पार से जुड़े ऊतक स्टोर । 3. कोशिका या ऊतक Lysis Lysis बफर तैयार (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 10 mm EDTA, 1% एसडीएस एक RNAse अवरोध करनेवाला समाधान के 200 U/एमएल के साथ पूरक, और एक कॉकटेल अवरोध करनेवाला 5 µ l/ पहले गल बिना लीजड ड नमूनों को प्राप्त करने के लिए, पुन: निलंबित सेल छर्रों या पार से जुड़े ऊतकों को इस बफर के साथ (लगभग 1 मिलीलीटर सेल गोली या ऊतक के 100 मिलीग्राम प्रति). एक सेल 1 एक्स 10 से प्राप्त की गोली7 कोशिकाओं को एक लीजड ड प्रोटीन के लगभग 20 मिलीग्राम युक्त नमूने को जंम दे ।नोट: इस्तेमाल किया ऊतक पर निर्भर करता है, यांत्रिक व्यवधान का एक कदम जोड़ा जाना चाहिए. इस मामले में, यह अतिरिक्त कदम के दौरान नमूनों की हीटिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है । 4. Sonication sonication शर्तों का अनुकूलन 30 एस के 2 से 5 श्रृंखला पर और 30 एस के साथ sonicator कार्यक्रम । पतला लीजड ड नमूनों (कमजोर पड़ने फैक्टर ½ या लगभग 10 या 5 मिलीग्राम प्रोटीन के लिए इसी ¼) पर sonication शर्तों का अनुकूलन करने के लिए परीक्षण निष्पादित करें । 4 ° c पानी स्नान में पतला लीजड ड नमूनों प्लेस और sonication श्रृंखला शुरू करते हैं । या तो एक आरएनए शुद्धि किट के साथ या एक आरएनए अलगाव रिएजेंट के साथ RNAs शुद्ध (उदा., Trizol) । TBE बफर में एक 1% agarose जेल ट्रो पर शुद्ध आरएनए की समग्रता लोड, आरएनए टुकड़े की लंबाई की जाँच करें. यह लंबाई 200 और 800 बीपी के बीच सीमा चाहिए ।नोट: आरएनए टुकड़ा आकार के आधार पर, विरोधी भावना oligonucleotide ‘ जांच दक्षता भिन्न हो सकते हैं. यह तो sonication की विभिन्न परिस्थितियों के तहत जांच की दक्षता की जांच करने के लिए सिफारिश की है । लीजड ड नमूनों की Sonication जगह लीजड ड नमूने 20 प्रोटीन के मिलीग्राम (4 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में (3.2 कदम के बाद प्राप्त) और के रूप में चरण 4.1 में अनुकूलित sonication श्रृंखला शुरू करते हैं । तुरंत sonication के बाद, 4 डिग्री सेल्सियस पर 12,000 ग्राम में 5 मिनट के लिए केंद्रापसारक । स्थानांतरण supernatants नए केंद्रापसारक ट्यूबों में ।नोट: एकरूपता सुनिश्चित करने के लिए, सूचना को दोहराने supernatants को इस चरण में परित और पुनः वितरित किया जा सकता है । 5. आरएनए पुल-डाउन दिन 1-संकरण कदम संकरण बफर के 2 खंड जोड़ें (50 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 750 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 1% एसडीएस, 15% Formamide जोड़ा extemporaneously) sonication चरण के बाद एकत्र supernatants करने के लिए । भंवर. एक केंद्रापसारक ट्यूब में प्रत्येक नमूने के 20 µ एल स्थानांतरण (इनपुट नमूने) और स्टोर पर-20 ° c । biotinylated oligonucleotide जांच के 100 pmol जोड़ें (विशिष्ट या गैर-विशिष्ट; तालिका 1देखें) प्रत्येक नमूने के लिए । आर टी पर एक ट्यूब रोटेटर पर उदारवादी आंदोलन के तहत 4 से 6 घंटे की मशीन एक RNAse अवरोधक समाधान के 200 U/एमएल के साथ पूरक चुंबकीय streptavidin मोतियों की 50 µ एल जोड़ें और एक कॉकटेल अवरोधक 5 µ एल/ आर टी पर ट्यूब रोटेटर पर उदारवादी आंदोलन के तहत रात भर गर्मी 2 दिवस-आरएनए अलगाव कदम सेल lysate से मोती अलग करने के लिए चुंबकीय समर्थन का प्रयोग करें, supernatant त्यागें, और धो बफर के 900 µ एल के साथ मोती धोने (एसडीएस 0.5%, एसएससी 2x) । आरटी पर रोटेटर पर 5 मिनट के आंदोलन के साथ 5 बार interspersed दोहराएँ । पिछले धोने के बाद, एक आखिरी बार खिचड़ी भाषा और Proteinease k बफर के 95 µ एल जोड़ने (10 मिमी Tris-एचसीएल पीएच 7.0, 100 मिमी NaCl, 1 मिमी EDTA, 0.5% एसडीएस) और µ-कश्मीर के 5 proteinase एल (20 मिलीग्राम/एमएल) के नमूने लिए । बर्फ पर, इनपुट नमूनों (20 μL) गल और Proteinease k बफर के 75 µ एल जोड़ने और proteinase-कश्मीर (20 मिलीग्राम/एमएल) के 5 µ एल । proteinase K के साथ सभी नमूनों को 50 डिग्री सेल्सियस पर 45 मिनट के लिए, 95 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट की मशीन करें । चुंबकीय समर्थन के साथ RNAs से मोतियों को अलग करने से पहले 3 मिनट के लिए बर्फ पर नमूना ठंडा । supernatant को रखें और मोतियों का त्याग करें । एक आरएनए शुद्धि किट के साथ शुद्ध RNAs, जिसमें डीएनए पाचन कदम शामिल होना चाहिए । स्टोर RNAs-80 ° c । प्रदर्शन रिवर्स प्रतिलेखन qPCR (rt-qPCR) एक आरटी किट का उपयोग कर qPCR द्वारा पीछा किया विशिष्ट प्राइमर (तालिका 1) । दो आरएनए पूल विशिष्ट Neat1 जांच (तालिका 1) में से प्रत्येक के साथ प्राप्त करने के लिए इसी के दोनों डीएनए पुस्तकालयों का निर्माण । एक अगली पीढ़ी के अनुक्रमण प्रणाली पर अनुक्रमण करते हैं ।

Representative Results

हाल के कई अध्ययनों से पता चला है कि lncRNAs लगभग हर महत्वपूर्ण जैविक प्रक्रिया में एक आवश्यक भूमिका निभाते है और यह भूमिका जीन दोनों transcriptional और पोस्ट transcriptional स्तर पर होने वाली अभिव्यक्ति के नियंत्रण के माध्यम से हासिल की है इस उत्तरार्द्ध मामले में दिखा रहा है कि RNAs lncRNAs6का लक्ष्य हो सकता है । lncRNA परमाणु प्रचुर मात्रा में प्रतिलिपि 1 (Neat1) समृद्ध frontotemporal मनोभ्रंश, पेशीशोषी पार्श्व स्केलेरोसिस, या मिर्गी8,9,10के रूप में अलग neuropathologies में फंसा है, और भी अनियमित है अलग तरह के कैंसर11,12में । इस lncRNA भी विशिष्ट परमाणु निकायों, paraspeckles के संरचनात्मक घटक होने के लिए जाना जाता है, और जीन अभिव्यक्ति13के बाद transcriptional circadian विनियमन में शामिल होने के लिए । Paraspeckles कि हर कोशिका नाभिक में पाया जाता है और न केवल Neat1, जो उनके गठन के लिए आवश्यक है के आसपास का गठन कर रहे हैं, लेकिन यह भी कई आरएनए बंधन प्रोटीन (RBP)14के आसपास, वास्तव में नाभिक के भीतर आरएनए लक्ष्यों को बनाए रखने में सक्षम होने के लिए जाना जाता है15 . paraspeckles के गठन के विभिंन घटकों के संघ के माध्यम से हासिल की है । इस गठन के लिए एक circadian लयबद्ध शाही आरएनए के एक लयबद्ध परमाणु प्रतिधारण ड्राइविंग पैटर्न प्रदर्शन दिखाया गया था13। paraspeckles द्वारा शाही सेना के लक्ष्यों की परमाणु प्रतिधारण RBP के लिए बाध्यकारी के माध्यम से या सीधे आरएनए/आरएनए एसोसिएशन के माध्यम से हो सकता है, लेकिन paraspeckles द्वारा लक्षित RNAs की सीमा निर्धारित किया जाना था । आरएनए की पहचान करने के लिए सीधे या परोक्ष रूप से Neat1 द्वारा लक्षित, एक आरएनए पुल डाउन प्रोटोकॉल डिजाइन किया गया था कि अलगाव और सभी Neat1 आरएनए की पहचान के रूप में अच्छी तरह से ऊतक नमूनों में प्रसंस्कृत कोशिकाओं में लक्ष्य की अनुमति देता है ( चित्रा 1 देखें के लिए एक चित्रमय तकनीक की प्रस्तुति) । प्रोटोकॉल भी सफलतापूर्वक एक और lncRNA मेटास्टेसिस संबद्ध फेफड़ों ग्रंथिकर्कटता प्रतिलिपि 1 (Malat1) के आरएनए लक्ष्यों की पहचान करने के लिए लागू किया गया था । Malat1 एक उच्च संरक्षित है और व्यक्त lncRNA कई आरएनए ब्याह कारकों के साथ एक साथ परमाणु speckles में पाया । Malat1 कई नवजात प्री-mRNA16,17के ब्याह के नियमन में शामिल होने के लिए जाना जाता है । विशिष्ट (सू) और गैर विशिष्ट oligonucleotide (स ंस्) जांच यहां वर्णित जांच डिजाइन रणनीति का उपयोग कर उत्पंन किया गया । यह रणनीति उन क्षेत्रों के चयन पर निर्भर करती है जो lncRNA की द्वितीयक संरचना द्वारा भविष्यवाणी की गई और इन क्षेत्रों के लिए एक मजबूत संबध के साथ विशिष्ट जांचों के डिज़ाइन के अनुसार, आंतरिक आधार युग्मन की कम प्रायिकता प्रदर्शित करते हैं । इन bioinformatics भविष्यवाणियों के एक प्रतिनिधि परिणाम के रूप में, Neat1 के एक अनुक्रम की भविष्यवाणी की माध्यमिक संरचना की एक तस्वीर (न्यूक्लियोटाइड १,४८० 2,000) दो डिजाइन की स्थिति के साथ एक साथ तो जांच चित्रा 2में दिए गए हैं । डिजाइन जांच चूहे Neat1 या Malat1 GH4C1 प्रसंस्कृत कोशिकाओं के लिए और पिट्यूटरी ऊतक निष्कर्षों के लिए माउस Neat1 के लिए निर्देशित किया गया (तालिका 1) । Neat1 या Malat1 में सापेक्ष संवर्धन इनपुट नमूनों के सापेक्ष गैर विशिष्ट और विशिष्ट जांच के लिए गणना की गई थी । चित्रा 3 विशिष्ट जांच की दक्षता से पता चलता है Neat1 चूहा GH4C1 पिट्यूटरी सेल लाइन (चित्रा 3) में नीचे खींचने के लिए और माउस पिट्यूटरी ऊतक निष्कर्षों में (चित्र बी). जब जांच डिजाइन प्रोटोकॉल का उपयोग करने के लिए विशिष्ट oligonucleotide उत्पंन (तो) जांच Malat1 के लिए निर्देशित, एक कुशल जांच प्राप्त किया गया था जबकि एक अंय पर्याप्त कुशल नहीं था और छोड़ दिया गया था (चित्र 4a) । RT-qPCR प्रयोगों के बाद एक आरएनए पुल-डाउन प्रक्रिया के बाद, विशिष्ट प्राइमरों (तालिका 1) के साथ मूल्यांकन किए गए कुछ RNAs को GH4C1 अर्क में Neat1 या Malat1 के साथ संबद्ध होने के लिए दिखाया गया था । GH4C1 सेल अर्क में Neat1 से जुड़े RNAs को भी पिट्यूटरी ऊतक के अर्क में Neat1 से संबद्ध दिखाया गया. दरअसल, Neat1 आरएनए पुल-डाउन होने के बाद, Malat1 को GH4C1 सेल लाइन में और पिट्यूटरी माउस ऊतक निष्कर्षों (चित्र 5) में दोनों Neat1 द्वारा लक्षित किया जाना पाया गया था । पारस्परिक रूप से, Neat1 काफी समृद्ध था Malat1 आरएनए खींचने के बाद GH4C1 कोशिकाओं (चित्रा 4B) में एक विशिष्ट जांच के साथ प्रदर्शन किया. दो lncRNAs के बीच घनिष्ठ संबंध को हाइलाइट करके, इन परिणामों के संभावित सह-विनियामक भूमिका के साथ संगत है Neat1 और Malat1 Malat1 नॉकआउट चूहों द्वारा सुझाए गए जो Neat1 आरएनए अभिव्यक्ति18में भिन्नता प्रदर्शित करते हैं, 19. दो मुख्य पिट्यूटरी हार्मोन, वृद्धि हार्मोन (Gh) (चित्रा 5B) और प्रोलैक्टिन (Prl) (चित्रा 5C) के टेप काफी Neat1 कोशिकाओं और पिट्यूटरी दोनों में विशिष्ट जांच के साथ pull-डाउन के बाद से समृद्ध थे अर्क, Neat1 द्वारा दो हार्मोन का एक संभव विनियमन का सुझाव । जब दो विशिष्ट जांच इस्तेमाल की तुलना, यह प्रकट है कि उनकी दक्षता आरएनए पर विचार लक्ष्य (चित्रा 5B और चित्रा 5C) के आधार पर भिन्न हो सकता है. इन परिणामों में कई विशिष्ट जांच डिजाइन की आवश्यकता को उजागर करने के लिए न केवल पुल नीचे lncRNA के संवर्धन में सबसे अच्छा दक्षता प्रदर्शित उन का चयन करने के लिए, लेकिन यह भी अपनी आरएनए लक्ष्य के संवर्धन में सबसे अच्छी दक्षता । आरएनए पुल नीचे विधि भी एक lncRNA के हित की एक शाही सेना के लक्ष्यों की व्यापक सूची प्राप्त करने के लिए आरएनए उच्च प्रवाह अनुक्रमण द्वारा पीछा किया जा सकता है13. Neat1 आरएनए के बाद GH4C1 पिट्यूटरी कोशिकाओं पर एक आरएनए-seq विश्लेषण पुल-डाउन का उपयोग कर दो विशिष्ट जांच के बाद ऊपर वर्णित किया गया था. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि एक स ंस् का उपयोग कर एक नकारात्मक नियंत्रण भी आरएनए-seq विश्लेषण के अधीन किया जा सकता है, आरएनए के साथ पुल-नीचे स ंस् के बाद बरामद का स्तर पुस्तकालयों के निर्माण की अनुमति देने के लिए पर्याप्त है. यह मामला पिछले अनुभव13में नहीं था । पुस्तकालयों कि विशिष्ट जांच के उपयोग के बाद उत्पंन किया गया Tophat/कफ़लिंक पाइपलाइन का उपयोग कर विश्लेषण किया गया था20 और केवल टेप के मूल्यों के साथ अंश प्रति kilobase प्रति दस लाख (FPKM) से अधिक 1 खाते में ले जाया गया । Neat1 को निर्देशित दो विशिष्ट जांचों (तालिका 1) के साथ प्राप्त सूचियों को परिणामों की विशिष्टता का आकलन करने के लिए क्रॉस किया गया । ४,२६८ जीन paraspeckles, जो GH4C1 कोशिकाओं13में व्यक्त टेप के 28% का प्रतिनिधित्व के साथ जुड़े पाए गए । qPCR विश्लेषण (चित्र धारा 5-सी) का उपयोग कर प्राप्त परिणामों के अनुरूप, Gh, Prl, और Malat1 के टेप Neat1 के साथ जुड़े होने के लिए पाए गए. आरएनए पुल डाउन विधि इसलिए lncRNAs और उनके आरएनए लक्ष्य के बीच बातचीत का पता लगाने के लिए एक कुशल उपकरण साबित हो गया है. चित्रा 1: आरएनए की चित्रमय प्रतिनिधित्व प्रक्रिया नीचे खींच. पहले दिन पर, paraformaldehyde, लीजड ड, और sonicated के साथ biotinylated विशिष्ट जांच को जोड़कर किया गया था संकरण चरण से पहले कक्ष या ऊतक cross-linked थे । चुंबकीय streptavidin मोती तो सेल lysate के बाकी हिस्सों से अलग विशिष्ट सामग्री के लिए जोड़ा गया । दूसरे दिन, मोतियों को एक चुंबक से अलग कर रहे थे और कई बार धोया । एक de-crosslinking कदम RNAs कि शुद्ध और RT-qPCR या आरएनए-seq विश्लेषण के लिए इस्तेमाल किया गया की वसूली की अनुमति दी । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 2: एक Neat1 अनुक्रम के माध्यमिक संरचना (न्यूक्लियोटाइड १,४८० से 2,000) के रूप में bioinformatics संसाधन (RNAstructure वेब सर्वर, निंनतम मुक्त ऊर्जा संरचना) द्वारा भविष्यवाणी की । संरचना आधार बाँधना की संभाव्यता की डिग्री के अनुसार रंग का है । लाल रंग में दो oligonucleotides जांच (SO1 और SO2) Neat1 आरएनए संरचना के साथ तैनात हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 3: Neat1 संवर्धन बनाम इनपुट के qPCR सत्यापन । Neat1 संवर्धन बनाम इनपुट के qPCR सत्यापन के बाद Neat1 आरएनए दो अलग विशिष्ट जांच (SO1-आरएन और SO2 कोशिकाओं और GH4C1 के लिए SO1-आरएन द्वारा नीचे खींच-mm और SO2-mm पिट्यूटरी ऊतक के लिए) एक गैर-विशिष्ट एक की तुलना में (के लिए स ंस्-आरएन GH4C1 कोशिकाओं और के लिए स ंस्-mm GH4C1 चूहा कोशिकाओं में पिट्यूटरी ऊतक) (एक) और माउस पिट्यूटरी ऊतक निष्कर्षों में (बी). परिणाम ± SEM 3 से 10 प्रयोगों में प्राप्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 4: Malat1 आरएनए नीचे खींचने के बाद Malat1 और Neat1 संवर्धन बनाम इनपुट के qPCR सत्यापन. Malat1 (ए) और Neat1 (बी) संवर्धन बनाम qPCR के सत्यापन के बाद Malat1 आरएनए दो अलग विशिष्ट जांच (SO3-आरएन और SO4-आरएन) के रूप में स ंस् चूहा कोशिकाओं में एक गैर विशिष्ट एक (GH4C1-आरएन) की तुलना में नीचे खींच । परिणाम ± SEM 3 प्रयोगों में प्राप्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । चित्रा 5: Neat1 आरएनए नीचे खींचने के बाद Malat1, Gh, Prl संवर्धन बनाम इनपुट के qPCR सत्यापन. Malat1 (A), Gh (B), Prl (C) संवर्धन बनाम qPCR के सत्यापन के बाद Neat1 आरएनए के रूप में अलग विशिष्ट जांच का उपयोग कर नीचे खींचने के लिए GH4C1 चूहा कोशिकाओं और माउस पिट्यूटरी ऊतक के अर्क में एक गैर विशिष्ट एक की तुलना में. परिणाम ± SEM 3 से 8 प्रयोगों में प्राप्त कर रहे हैं । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए । जांच के नाम दृश्यों स ंस्-आरएन TAAAATACCATTTGATGTTTGAAATTAT SO1-आरएन CTCCACCATCATCAATCCTCTGGAC SO2-आरएन GCCTTCCCACATTTAAAAACACAAC SO3-आरएन AACTCGTGGCTCAAGTGAGGTGACA SO4-आरएन AAGACTCTCAGGCTCCTGCTCATTC स ंस्-एमएम GTTTGTGGTTTAACAGTGGGAAGGC SO1-एमएम GCCTTCCCACTGTTAAACCACAAAC SO2-एमएम CTCACCCGCACCCCGACTCCTTCAA qPCR प्राइमर: Rattus norvegicus Neat1 AAGGCACGAGTTAGCCGCAAAT TGTGCACAGTCAGACCTGTCATTC Malat1 GAAGGCGTGTACTGCTATGCTGTT TCTCCTGAGGTGACTGTGAACCAA Gh1 CCGCGTCTATGAGAAACTGAAGGA GGTTTGCTTGAGGATCTGCCCAAT prl TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA मस musculus Neat1 TGGGCCCTGGGTCATCTTACTAGATA CACAGCTGTTCCAATGAGCGATCT Gh1 CTCGGACCGTGTCTATGAGAAACTGA TTTGCTTGAGGATCTGCCCAACAC prl TGAACCTGATCCTCAGTTTGGT AGCTGCTTGTTTTGTTCCTCAA तालिका 1: डीएनए oligonucleotide जांच और qPCR प्राइमरों का जुगाड़

Discussion

उनकी संख्या और विविधता द्वारा लंबे समय से कोडिंग RNAs (lncRNAs) अनुसंधान के एक बड़े क्षेत्र का प्रतिनिधित्व करते है और उनकी भूमिकाओं के अधिकांश अभी भी खोज की जानी है । इन lncRNAs के कई एक परमाणु स्थानीयकरण है और उनमें से, कुछ transcriptional या posttranscriptional तंत्र के माध्यम से जीन अभिव्यक्ति के विनियामक रास्ते में फंसा रहे हैं । इस क्षेत्र में मौजूदा चुनौतियों में से एक RNAs के पोस्ट-transcriptional प्रोसेसिंग में उन lncRNAs की प्रासंगिकता को समझना है । इस प्रयोजन के लिए, lncRNAs द्वारा लक्षित RNAs की पहचान की जानी है । पिछले क्रोमेटिन के साथ lncRNAs के संघ पर ध्यान केंद्रित अध्ययन से प्रेरित होकर, हम एक प्रक्रिया है कि एक lncRNA के साथ जुड़े RNAs की पहचान की अनुमति देता है विकसित की है । इस प्रोटोकॉल की सफलता, नाम आरएनए पुल नीचे, मुख्य रूप से दो महत्वपूर्ण कदम पर निर्भर है, अर्थात् विरोधी भावना डीएनए oligonucleotide जांच के डिजाइन कि विशेष रूप से और विशेष रूप से ब्याज की lncRNA के साथ संकरण है, और ऊतक की शर्तों या सेल निर्धारण कि सभी आणविक भागीदारों के बीच नेटवर्क की अखंडता को बनाए रखने के लिए है ।

पहले प्रकाशित प्रोटोकॉल के साथ एक lncRNA को अलग करने के लिए कार्यविधियाँ प्रदान की इसके संबद्ध क्रोमेटिन अनुक्रम (कलरव^1,2, चार्ट^3,4) । उन प्रोटोकॉल में, विभिंन रणनीतियों के लिए विरोधी भावना डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन कार्यरत थे । कलरव प्रक्रिया में, लेखकों डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच के एक पूल सभी निरर्थक और गैर विशिष्ट जांच के बहिष्कार के बाद ब्याज की lncRNA की पूरी लंबाई को शामिल किया^1,2। चार्ट प्रोटोकॉल में, लेखकों ने lncRNA के उन क्षेत्रों की पहचान की जो संकरण और डिज़ाइन कैप्चर oligonucleotides के लिए अधिक पहुंच वाले है जो इन क्षेत्रों को लक्षित करते हैं । इन क्षेत्रों का चयन उनके RNase-ज संवेदनशीलता के आधार पर किया गया । दरअसल, आरएनए-डीएनए बाइंडिंग की साइटों पर hydrolyze RNAs के लिए RNAse-एच की संपत्ति का उपयोग कर, oligonucleotides कि संकरण में सुलभ साइटों के लिए lncRNA आरएनए-डीएनए संकर का उत्पादन और एंजाइमी के lncRNA दरार करने के लिए सीसा । लेखकों ने इनमें से तीन परीक्षार्थी कैप्चर oligonucleotides चुने और उन्हें एक कॉकटेल^3,4में इस्तेमाल किया.

प्रक्रिया हम विरोधी भावना डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए इस्तेमाल किया है कि चार्ट प्रोटोकॉल में इस्तेमाल के करीब था, लेकिन वांछित lncRNA के संकरण उपलब्ध क्षेत्रों उनके RNAse-एच संवेदनशीलता के आधार पर चयनित नहीं थे, लेकिन lncRNA माध्यमिक संरचना के bioinformatics मॉडलिंग के रूप में निर्धारित आंतरिक आधार बाँधना की उनकी कम संभावना के अनुसार. यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि विभिंन माध्यमिक संरचनाओं अलग एल्गोरिदम का उपयोग कर भविष्यवाणी की जाएगी, और जांच उन है कि माध्यमिक संरचनाओं की सबसे बड़ी संख्या में lncRNA के उपलब्ध दृश्यों के लिए संकरण होना चाहिए चुना है की भविष्यवाणी की । एक ही परिणाम के तीन डिजाइन, विशिष्ट जांच या एक एकल जांच व्यक्तिगत रूप से या तो एक कॉकटेल का उपयोग कर प्राप्त किया गया । यह दो अलग, विशिष्ट जांच और उन है कि इन दो जांच करने के लिए आम है के रूप में सकारात्मक परिणाम के विचार के उपयोग के लिए प्रेरित किया । अंत में, यह इसलिए विधि के विकास की शुरुआत में सिफारिश की है, एक इष्टतम परिणाम के लिए और पुल नीचे के परिणामों की विशिष्टता का आकलन करने में सक्षम हो, 3 अलग विरोधी भावना oligonucleotide जांच डिजाइन करने के लिए और फिर तुलना करने के लिए प्रयोगात्मक उनकी दक्षता, खासकर के बाद से जांच दक्षता सेल lysate तैयारी द्वारा बदला जा सकता है । फिर भी, जांच डिजाइन की प्रक्रिया lncRNA माध्यमिक संरचना हम इस्तेमाल की bioinformatics मॉडलिंग पर आधारित है कि टाइलिंग oligonucleotide जांच के पूल पर आधारित से भी कम महंगा रह गया है², और इस पर आधारित विधि की तुलना में कम समय लगता था पर RNAse-H संवेदनशीलता⁴.

एक नकारात्मक नियंत्रण भी नकारात्मक कब्जा oligonucleotide के रूप में उपयोग किया जाना चाहिए या तो नब्ज डीएनए biotinylated oligonucleotide जांच या हाथापाई oligonucleotide जांच, या oligonucleotides एक असंबंधित आरएनए के खिलाफ निर्देश दिया । क्योंकि प्राकृतिक antisense टेप lncRNAs, नब्ज oligonucleotide जांच के उपयोग के अस्तित्व के कारण कभी भी अपर्याप्त हो सकता है । नकारात्मक नियंत्रण के लिए चयनित oligonucleotide जांच की परवाह किए बिना, यह एक ज्ञात आरएनए के साथ संकरण नहीं करता है कि विस्फोट से जाँच करने के लिए आवश्यक है और इस oligonucleotide एक अभी भी संयुक्त राष्ट्र व्याख्या lncRNA करने के लिए संकरण कर सकते हैं कि मन में रखने के लिए.

इन आरएनए खींचने के प्रयोगों में प्रयुक्त सेल lysates 10⁶ से 10⁷ कोशिकाओं से प्राप्त किया गया जब संस्कृतिपूर्ण कोशिकाओं के साथ काम कर रहे हैं, और 1 से 10 मिलीग्राम जब ऊतक के साथ काम कर रहे. सेल lysates की तैयारी ऊतक या कोशिका दो मुख्य कदम है कि अनुकूलित किया जाना है के साथ प्रयोग प्रकार के अनुसार अनुकूलित करने की जरूरत है: अर्थात्, पार से जोड़ने कदम है कि lncRNA और उसके आणविक भागीदारों के बीच आबंध बांड के गठन की अनुमति देता है, और sonication कदम है कि बहुत तकलीफ क्रोमेटिन द्वारा चिपचिपापन कम कर देता है ।

पार से जोड़ने के कदम का उद्देश्य यह सुनिश्चित करना है कि सभी आरएनए लक्ष्य सभी आणविक भागीदारों के बीच एक नेटवर्क के गठन को प्रेरित करके lncRNA के लिए बंद रहते हैं । एक paraformaldehyde उपचार कदम है कि lncRNA और उसके भागीदारों के बीच आबंध बांड फार्म होगा नेटवर्क reticulated होने की अनुमति देता है. चार्ट प्रोटोकॉल में, यह सुझाव दिया गया था अगर परमाणु lncRNA के साथ काम करने, पूरे सेल lysate पर paraformaldehyde के साथ एक प्राथमिक उपचार करने के लिए और अलग न्यूक्लिक अंश^3,4पर एक दूसरा उपचार । हमने देखा है कि इस अनुपूरक कदम की जांच की दक्षता में कमी आई, शायद कोशिकाओं में lncRNA पहुंच को कम करने के द्वारा । इसलिए, paraformaldehyde द्वारा reticulation की डिग्री खाते में सेल या ऊतक प्रकार इस्तेमाल ले अनुकूलित किया जाना है, ब्याज की lncRNA के स्थानीयकरण, और डिजाइन जांच की दक्षता ।

जबकि कोशिकाओं lysing, क्रोमेटिन lysate में जारी किया गया है और इसकी चिपचिपाहट बढ़ जाती है; यह तो नमूनों की तरलता बढ़ाने के लिए sonication द्वारा क्रोमेटिन टुकड़ा करने के लिए आवश्यक है और इसलिए ब्याज की lncRNA के लिए oligonucleotide जांच की पहुंच की सुविधा । हालांकि, sonication भी RNAs ब्याज की lncRNA के साथ निकाले टुकड़ा होगा । यह तो यह कुशलतापूर्वक lysate की चिपचिपाहट को कम कर देता है कि एक तरह से sonication के समय को कम करने के लिए महत्वपूर्ण है, यह भी 200-800 बीपी के बीच शामिल एक लंबाई के साथ आरएनए टुकड़े की प्राप्त करने की अनुमति देती है. ध्यान दें कि sonication समय अत्यधिक हो जाएगा दोनों मात्रा और ऊतक या प्रसंस्कृत कोशिकाओं के प्रकार का इस्तेमाल किया पर निर्भर है ।

अंत में, यहां वर्णित प्रक्रिया 2-3 दिनों में एक वांछित lncRNA के आरएनए लक्ष्य का कब्जा में सक्षम बनाता है । RT-qPCR के साथ युग्मित, इन तरीकों को एक विशिष्ट संघ और एक उंमीदवार के रूप में वांछित lncRNA द्वारा एक mRNA के विनियमन की तलाश की अनुमति होगी । एक जीनोम चौड़ा दृष्टिकोण के लिए, आरएनए खींच-नीचे प्रयोगों वांछित lncRNA के साथ जुड़े सभी RNAs की पुनर्प्राप्ति की अनुमति उच्च प्रवाह आरएनए-अनुक्रमण द्वारा विश्लेषण किया जा सकता है । जो भी विश्लेषणात्मक रणनीति चुनी, आरएनए पुल डाउन प्रक्रिया lncRNAs द्वारा आरएनए विनियमन पर नए महत्वपूर्ण ज्ञान प्रदान करना चाहिए.

Materials

Bioruptor Plus	Diagenode	B01020001	Sonicator
Dynabeads My One	Thermo-Fisher	65001	Magnetic streptavidin beads
Formamide	Thermo-Fisher	15515-026
Gel electrophoresis apparatus	Advance	Mupid-One	Gel electrophoresis apparatus
Proteinase K	Sigma	P2308
RNA XS purification kit	Macherey-Nagel	740902	RNA purificationkit
RNAseOUT	Thermo-Fisher	10777-019	RNAse inhibitor
Trizol	Thermo-Fisher	15596018	RNA purification
Tube Rotator	Stuart	SB2	Eppendorf tube rotator
RNA to DNA	Thermo-Fisher	4387405	Reverse transcription kit
iTaq Universal SYBR Green Supermix	BioRad	1725124	qPCR reagent
Applied 7500 Fast	Thermo-Fisher	4351107	qPCR apparatus
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit	Illumina	20020594	DNA library construction kit
Illumina NextSeq 500	Illumina	SY-415-1002	NGS system