يسمح هذا الأسلوب المنسدلة الجيش الملكي النيبالي بتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي رنا الطويل غير الترميز (لنكرنا). استناداً إلى التهجين للصنع، ومصممة بمعنى المضادة الحمض النووي اليغنوكليوتيد تحقيقات محددة لهذا لنكرنا في الأنسجة الثابتة على النحو المناسب أو خط الخلية، فإنه يسمح لكفاءة القبض على جميع أهداف الجيش الملكي النيبالي لنكرنا.
منذ فترة طويلة غير الترميز الحمض النووي الريبي (لنكرنا)، وتسلسل النيوكليوتيدات أكثر من 200 دون إطار قراءة معرفة، تنتمي إلى عائلة رنا الترميز غير التنظيمية. ورغم أن وظائفها البيولوجية لا تزال غير معروفة إلى حد كبير، قد ازداد باطراد العدد من هذه لنكرناس ويقدر الآن أن البشر قد 10,000 أكثر من هذه النصوص. وبعض هذه معروفة للمشاركة في مسارات تنظيمية هامة للتعبير الجيني التي تجري على المستوى النسخي، ولكن أيضا في خطوات مختلفة للجيش الملكي النيبالي المشارك-والنضج بوستترانسكريبشونال. وفي الحالتين، يكون الكشف التي تستهدفها في لنكرنا اسمه. هذا هو السبب في أنها مفيدة لتطوير طريقة تمكين تحديد للكشف المرتبطة مباشرة أو غير مباشرة مع لنكرنا للفائدة.
هذا البروتوكول، الذي استلهم من البروتوكولات نشرت سابقا السماح بعزل لنكرنا جنبا إلى جنب مع تسلسل الكروماتين المرتبط به، وقد تم تكييف للسماح بعزل الكشف المرتبطة بها. عقدنا العزم أن هاتين الخطوتين في غاية الأهمية للكفاءة لهذا البروتوكول. الأول هو تصميم محددة معنى المضادة الحمض النووي اليغنوكليوتيد المسابير قادرة على هجن إلى لنكرنا للفائدة. تحقيقا لهذه الغاية، كان توقع هيكل الثانوية لنكرنا بالمعلوماتية الحيوية والمسابير اليغنوكليوتيد المضادة معنى صممت مع صلة قوية للمناطق التي تعرض احتمال الضعيف لإقران قاعدة داخلية. الخطوة الحاسمة الثانية من الإجراءات تعتمد على شروط مثبت للأنسجة أو استزراع الخلايا التي تحتوي على الحفاظ على شبكة الاتصال بين جميع الشركاء الجزيئية. مقترنة بتسلسل الحمض النووي الريبي إنتاجية عالية، يمكن أن توفر هذا البروتوكول المنسدلة الجيش الملكي النيبالي إينتيراكتومي الجيش الملكي النيبالي كله من لنكرنا للفائدة.
والهدف العام للأسلوب الموصوفة هنا تحديد شركاء الجزيئية الجيش الملكي النيبالي فضله منذ فترة طويلة في الجيش الملكي النيبالي (لنكرنا). وتناظر لنكرنا متواليات النيوكليوتيدات أكثر من 200 دون إطار قراءة محددة. البعض منهم قد ثبت أن تشارك في تنظيم تعبير الجينات، ليس فقط على المستوى النسخي، ولكن أيضا في خطوات مختلفة للجيش الملكي النيبالي المشارك-والنضج بوستترانسكريبشونال. وفي الحالتين، هي الجزيئية شركاء لنكرنا الكشف التي يمكن تحديدها. ثم سيكون وسيلة تمكن من تحديد هوية من الكشف المرتبطة مباشرة أو غير مباشرة مع لنكرنا لمصلحة أساسية لتطوير.
سبق نشرها الأساليب، مثل “العزلة الكروماتين” “تنقية الحمض النووي الريبي” (غرد)1،2 والتقاط التهجين تحليل للحمض النووي الريبي الأهداف (المخطط)3،4، السماح باكتشاف الفائق البروتينات المرتبطة الحمض النووي الريبي ومواقع الربط الجينوم من لنكرنا محددة. في هاتين الطريقتين، كان المهجنة لنكرنا الاهتمام أولاً إلى بيوتينيلاتيد النوكليوتيد التكميلية، وكان المجمع ثم عزل باستخدام الخرز ستريبتافيدين. والفرق الرئيسي بين هذه التقنيات اثنين تتصل بتصميم المجسات التي تستهدف لنكرناس. غرد، استراتيجية مستوحاة من “الأسماك الجيش الملكي النيبالي”، تألفت من تصميم حمام سباحة قصيرة الحمض النووي اليغنوكليوتيد تحقيقات تكميلية لتجانب على طول لنكرنا. على العكس من ذلك، تكييف الكتاب في المخطط، مقايسة رسم خرائط “رناسي ح” في لنكرناس للتحقيق في المواقع المتاحة التهجين.
الإجراء المقترح للتصميم معنى المضادة الحمض النووي بيوتينيلاتيد اليغنوكليوتيد هنا المسابير استخدامات النمذجة المعلوماتية الحيوية ل الهيكل الثانوي لنكرنا5 لتحديد تحقيقات مع صلة قوية للمناطق التي تعرض احتمال الضعيف للداخلية قاعدة الاقتران. هذا الإجراء قد تتميز بأنها أقل تكلفة من تلك التي تستند إلى تجمعات لتبليطٍ اليغنوكليوتيد المسابير2 وتستغرق وقتاً أقل من تلك التي تستند إلى حساسية رناسي-ح4.
كما أن هناك مجموعة متزايدة من الأدلة لتنظيم الجينات بوستترانسكريبشونال لنكرناس6، أنها مفيدة جداً لوضع نهج تمكين الاستيلاء على الكشف التي أهداف لنكرنا. وعلاوة على ذلك، يمكن استخدامها لمعظم التطبيقات، كان النهج الأمثل سواء في استزراع الخلايا والأنسجة مقتطفات.
منذ فترة طويلة فضله الكشف (لنكرناس) بعدد وتنوع تمثل حقل كبير من البحوث، ومعظم أدوارها لا يزال يتم اكتشافها. العديد من هذه لنكرناس تعريب نووية وفيما بينها، بعض المتورطين في مسارات تنظيمية للتعبير الجيني من خلال آليات النسخي أو بوسترانسكريبشونال. واحدة من التحديات الحالية في هذا المجال أن نفهم أهمية تلك لنكرناس في المعالجة بوستترانسكريبشونال للكشف. لهذا الغرض، يكون الكشف التي يستهدفها لنكرناس اسمه. مستوحاة من الدراسات السابقة ركزت على ارتباط لنكرناس بلونين، وضعنا الداخلي الذي يسمح تحديد الكشف المقترنة لنكرنا. نجاح هذا البروتوكول، المسماة الجيش الملكي النيبالي سحب لأسفل، تعتمد أساسا على اثنين من الخطوات الحاسمة، إلا وهي تصميم مكافحة الشعور يسبر اليغنوكليوتيد الحمض النووي التي هجن حصرا وتحديداً مع لنكرنا للفائدة، وظروف الأنسجة أو تثبيت الخلية التي تحتوي على الحفاظ على سلامة الشبكة بين جميع الشركاء الجزيئية.
سبق نشر البروتوكولات التي توفر إجراءات لعزل لنكرنا جنبا إلى جنب مع تسلسل الكروماتين المرتبط به (غرد1،2،3،الرسم البياني4). في هذين البروتوكولين، استخدمت استراتيجيات مختلفة لتصميم يسبر اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى لمكافحة. في الإجراء غرد، يستخدم المؤلفون مجموعة من الحمض النووي بيوتينيلاتيد اليغنوكليوتيد تحقيقات شاملة على طول لنكرنا للفائدة بعد استبعاد جميع المسابر زائدة عن الحاجة وغير محددة1،2. في بروتوكول مخطط، وحددت مناطق لنكرنا التي أيسر منالاً التهجين الكتاب وتصميم النوكليوتيد الالتقاط التي تستهدف هذه المناطق. تم اختيار هذه المناطق على أساس حساسيتها رناسي-ح. في الواقع، استخدام الخاصية رناسي ح أن يتحلل الكشف على مواقع لربط الحمض النووي الريبي، النوكليوتيد أن هجن إلى مواقع موجوداً في لنكرنا إنتاج هجن الحمض الريبي النووي ويؤدي إلى الانقسام الانزيمية لنكرنا. الكتاب تحديد ثلاثة من هذه النوكليوتيد القبض على المرشح، واستخدمها في كوكتيل3،4.
الإجراء علينا استخدامها لتصميم المسابير اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى المضادة كانت قريبة من تلك المستخدمة في بروتوكول مخطط، ولكن مناطق التهجين المتاحة لنكرنا المرجوة لم اختيرت على أساس حساسيتها رناسي-ح، ولكن ووفقا لاحتمال منخفض لإقران قاعدة داخلية حسبما تقرره النمذجة المعلوماتية الحيوية للهيكل الثانوي لنكرنا. يجب أن يكون لاحظت أن مختلف الهياكل الثانوي سوف يمكن التنبؤ باستخدام خوارزميات مختلفة، وينبغي أن تكون تحقيقات تحديد تلك التي هجن إلى تسلسل المتاحة من لنكرنا في أكبر عدد من الهياكل الثانوية وتوقع. تم الحصول على نفس النتائج باستخدام أما كوكتيل من ثلاثة مصممة أو تحقيقات محددة أو إجراء تحقيق واحد على حدة. هذا ما دفع استخدام اثنين من تحقيقات منفصلة ومحددة، والنظر في نتائج إيجابية كتلك التي مشتركة بين هذه المسابر اثنين. وأخيراً، ولذلك ينصح في بداية تطوير الأسلوب، نتيجة مثلى ويَسْبِر ليتمكن من تقييم خصوصية نتائج السحب إلى أسفل، تصميم 3 اليغنوكليوتيد الإحساس بمكافحة مختلف ومن ثم مقارنة تجريبيا كفاءتها، لا سيما منذ أن يغير كفاءة التحقيق إعداد ليستي الخلية. ومع ذلك، إجراء تصميم المسبار على النمذجة المعلوماتية الحيوية من لنكرنا الثانوي ظل هيكل استخدمنا أقل تكلفة من التي تستند إلى تجمعات لتبليطٍ اليغنوكليوتيد المسابير2، وكان هذا أقل استهلاكاً للوقت من الطريقة القائمة على أساس وفي حساسية رناسي-ح4.
عنصر تحكم سلبية ينبغي أيضا إجراء استخدام كما يسبر التقاط السلبية اليغنوكليوتيد اليغنوكليوتيد بيوتينيلاتيد الحمض النووي معنى أو سارعت المسابير اليغنوكليوتيد، أو النوكليوتيد الموجهة ضد الحمض النووي الريبي لا علاقة لها. بسبب وجود النصوص العقاقير الطبيعية لنكرناس، قد يكون استخدام المسابير اليغنوكليوتيد الشعور أحياناً غير كافية. بغض النظر عن التحقيق اليغنوكليوتيد المحددة لعنصر التحكم السلبي، من الضروري للتحقق من الانفجار أنه لا هجن مع رنا معروفة ونضع في اعتبارنا أن يمكن هجن هذا اليغنوكليوتيد إلى لنكرنا لا تزال الأمم المتحدة مشروح.
وتم الحصول على ليساتيس الخلايا المستخدمة في هذه التجارب المنسدلة الجيش الملكي النيبالي من 106 إلى 107 الخلايا عند العمل مع الخلايا المستزرعة، ومن 1 إلى 10 مغ عند العمل مع الأنسجة. إعداد ليساتيس الخلية تحتاج إلى تكييفها وفقا لنوع النسيج أو الخلية المستخدمة مع اثنين من الخطوات الرئيسية التي يتعين أن يكون الأمثل: هي الخطوة cross-linking التي يسمح تكوين روابط تساهمية بين لنكرنا وشركائها الجزيئية، الخطوة سونيكاتيون الذي يقلل اللزوجة بتمزيق الكروماتين.
والهدف من هذه الخطوة cross-linking ضمان بقاء جميع أهداف الجيش الملكي النيبالي مغلقة إلى لنكرنا بتشكيل شبكة بين جميع الشركاء الجزيئية. خطوة معالجة بارافورمالدهيد التي سوف تشكل روابط تساهمية بين لنكرنا وشركائها تسمح الشبكة لتكون شبكية. في بروتوكول مخطط، واقترح إذا كانت تعمل مع لنكرنا النووية، لإجراء علاج أولى مع بارافورمالدهيد على العموم خلية ليساتي والثانية العلاج على كسر النووية المعزولة3،4. ولاحظنا أن هذه خطوة تكميلية انخفضت كفاءة التحقيقات، ربما بالحد من إمكانية الوصول إلى لنكرنا في الخلايا. ومن ثم، درجة تشابك بارافورمالدهيد إلى أن تتكيف مع مراعاة الخلية أو استخدام نوع الأنسجة، إضفاء الطابع المحلي على لنكرنا للفائدة، وكفاءة المسابر المصممة.
بينما ليسينج الخلايا، يتم تحريرها في ليساتي الكروماتين ويزيد عن اللزوجة؛ ومن ثم يسبر الضروري اجاد الكروماتين طريق سونيكيشن زيادة سيولة العينات و ومن ثم تسهيل إمكانية الحصول اليغنوكليوتيد إلى لنكرنا للفائدة. ومع ذلك، سوف أيضا اجاد sonication الكشف المستخرج مع لنكرنا للفائدة. ومن ثم تتألف المهم للتقليل من الوقت سونيكيشن في مثل هذه طريقة في حين أنه يقلل من كفاءة لزوجة، أنه أيضا يتيح الحصول على الحمض النووي الريبي الشظايا بطول بين 200-800 هناك علما بأن الوقت sonication ستكون عالية تعتمد على الكمية ونوع الأنسجة أو الخلايا المستزرعة المستخدمة.
وفي الختام، يتيح الإجراء الموضح هنا في 2-3 أيام القبض على أهداف الجيش الملكي النيبالي لنكرنا المرجوة. يقترن RT-قبكر، سوف تسمح هذه الأساليب تبحث عن رابطة محددة وتنظيم مرناً حسب لنكرنا المطلوبة كنهج مرشح. لاتباع نهج على نطاق الجينوم، يمكن تحليل الحمض النووي الريبي المنسدلة التجارب بالحمض النووي الريبي الفائق-تسلسل يتيح استرجاع جميع الكشف المرتبطة لنكرنا المطلوب. ينبغي أن توفر إجراء سحب لأسفل على الحمض النووي الريبي مهما كانت الاستراتيجية التحليلية المختارة، معارف هامة جديدة على لائحة الجيش الملكي النيبالي قبل لنكرناس.
The authors have nothing to disclose.
هذا العمل كان دعم من جامعة إيكس-مرسيليا ويزأر وممول بمنحه من “شركة فايزر مختبرات”.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |