Este método de suspenso de RNA permite identificar os alvos de RNA de um tempo não-codificantes do RNA (lncRNA). Baseado na hibridação de caseiras, concebidas antido sentidas oligonucleotide sondas de DNA específicas para este lncRNA em um tecido apropriadamente fixo ou linha de células, com eficiência permite a captura de todos os alvos de RNA do lncRNA.
Há muito tempo não-codificantes do RNA (lncRNA), que são sequências de mais de 200 nucleotídeos sem um frame de leitura definida, pertencem à família a regulamentar não-codificantes do RNA. Apesar de suas funções biológicas permanecem em grande parte desconhecidas, o número destes lncRNAs aumentou constantemente e agora estima-se que os seres humanos podem ter mais de 10.000 tais transcrições. Alguns destes são conhecidos para ser envolvido em importantes vias reguladoras da expressão do gene que ocorrem no nível transcricional, mas também em diferentes etapas de RNA co – e maturação pós-transcricional. Nos últimos casos, RNAs que são direcionadas pelo lncRNA tem que ser identificado. Essa é a razão por que é útil desenvolver um método que permite a identificação de RNAs associados diretamente ou indiretamente com um lncRNA de interesse.
Este protocolo, que foi inspirado por protocolos anteriormente publicados, permitindo o isolamento de um lncRNA em conjunto com suas sequências de cromatina associada, foi adaptado para permitir o isolamento de RNAs associados. Determinamos que dois passos são essenciais para a eficiência do presente protocolo. O primeiro é o projeto de específicos antisentidos do oligonucleotide sondas de DNA capazes de cruzar para o lncRNA de interesse. Para este efeito, a estrutura secundária de lncRNA foi prevista por bioinformática e antisentido do oligonucleotide sondas foram projetadas com uma forte afinidade com as regiões que exibem uma baixa probabilidade de emparelhamento base interna. A segunda etapa crucial do processo depende das condições fixador do tecido ou células cultivadas que tem que preservar a rede entre todos os parceiros moleculares. Juntamente com a sequenciação do ARN alto throughput, este protocolo suspenso de RNA pode fornecer a interactome toda de RNA de uma lncRNA de interesse.
O objectivo geral do método descrito aqui é identificar parceiros moleculares de RNA de um RNA não-codificante longo (lncRNA). LncRNA correspondem a sequências de mais de 200 nucleotídeos sem um frame de leitura definido. Alguns deles foram mostrados para ser envolvido na regulação da expressão gênica, não só a nível transcricional, mas também em diferentes etapas de RNA co – e maturação pós-transcricional. Nos últimos casos, parceiros moleculares da lncRNA são RNAs que devem ser identificados. Um método que permite a identificação de RNAs associados diretamente ou indiretamente com um lncRNA de interesse seria essencial para desenvolver.
Publicado anteriormente métodos, tais como isolamento de cromatina pela purificação de RNA (ChIRP)1,2 e capturar hibridização análise de RNA alvos (gráfico)3,4, permitem a descoberta da elevado-produção de Proteínas RNA-limite e sites de ligação genômica de um lncRNA específico. Em um desses dois métodos, o lncRNA de interesse primeiro foi hibridizada para biotinilado oligonucleotídeos complementares, e o complexo foi então isolado usando streptavidin grânulos. A principal diferença entre estas duas técnicas está relacionada com a concepção de sondas lncRNAs de destino. Piu, a estratégia inspirado pelo peixe de RNA, consistia em projetar uma piscina de curto complementares sondas de DNA do oligonucleotide para todo o comprimento do lncRNA de telha. Por outro lado, no gráfico, os autores adaptaram a um ensaio de mapeamento de RNase H na lncRNAs de sites disponíveis para hibridação da ponta de prova.
O procedimento proposto aqui ao design do oligonucleotide biotinilado do anti-sentido DNA utiliza sondas, bioinformática, modelagem de estrutura secundária de lncRNA5 para selecionar sondas com uma forte afinidade com as regiões que exibem uma baixa probabilidade de interno base de emparelhamento. Este procedimento tem a vantagem de ser menos caro do que os baseados em piscinas de azulejos do oligonucleotide sondas2 e consumir menos tempo do que aqueles que se baseiam na sensibilidade de RNAse-H4.
Como não há um corpo crescente de evidências para regulamento de gene pós-transcricional por lncRNAs6, é muito útil desenvolver uma abordagem que permite a captura de RNAs que são alvos de um lncRNA. Além disso, para ser utilizável para a maioria dos aplicativos, a abordagem foi otimizada tanto em culturas de células e tecidos extratos.
Há muito tempo não codificante RNAs (lncRNAs) pelo seu número e diversidade representam um grande campo de pesquisa e a maioria de seus papéis está ainda a ser descoberto. Muitos destes lncRNAs têm uma localização nuclear e entre eles, alguns estão implicados nas vias reguladoras da expressão gênica através de mecanismos transcriptional ou posttranscriptional. Um dos desafios atuais neste campo é entender a relevância dos lncRNAs em processamento pós-transcricional de RNAs. Para este efeito, RNAs alvo de lncRNAs tem que ser identificado. Inspirado por estudos anteriores focados na associação de lncRNAs com cromatina, desenvolvemos um procedimento que permite a identificação de RNAs associados com um lncRNA. O sucesso do presente protocolo, chamado RNA suspensos, é principalmente dependente de duas etapas cruciais, ou seja, o projeto da antisenso oligonucleotide DNA sondas que tenho especificamente e exclusivamente cruzar com a lncRNA de interesse e as condições do tecido ou fixação da pilha que tem que preservar a integridade da rede entre todos os parceiros moleculares.
Publicado anteriormente protocolos fornecidos procedimentos para isolar uma lncRNA juntamente com suas sequências de cromatina associada (ChIRP1,2,3,de gráfico4). Esses protocolos, diferentes estratégias foram empregadas para pontas de prova do oligonucleotide de biotinilado anti-sentido DNA de design. O procedimento de ChIRP, os autores utilizaram um pool de DNA biotinilado do oligonucleotide sondas englobando toda a extensão do lncRNA de interesse após a exclusão de todas as sondas redundantes e não-específica1,2. No protocolo de gráfico, os autores identificaram as regiões do lncRNA que são mais acessíveis para a hibridação em projetado captura oligonucleotides que nestas regiões de destino. Estas regiões foram selecionadas com base em sua sensibilidade de RNase-H. Com efeito, usando a propriedade de RNAse-H para hidrolisar RNAs aos sítios de ligação de RNA-DNA, os oligonucleotides que hibridizam para sites acessíveis na lncRNA produzem híbridos RNA-DNA e levam a clivagem enzimática do lncRNA. Os autores selecionados três dos oligonucleotides de captura candidatos e usaram-as em um coquetel3,4.
O procedimento que costumávamos design no anti-sentido DNA biotinilado do oligonucleotide sondas foi perto de usado no protocolo de gráfico, mas as regiões hibridização-disponível do lncRNA desejado não foram selecionadas com base em sua sensibilidade de RNAse-H, mas de acordo com a sua baixa probabilidade de emparelhamento base interna conforme determinado pela modelagem de bioinformática da estrutura secundária de lncRNA. Ele deve ser notado que irão prever-se diferentes estruturas secundárias usando algoritmos diferentes, e sondas a serem selecionados devem ser aqueles que hibridizam às sequências disponíveis do lncRNA do maior número de estruturas secundárias que previu. Os mesmos resultados foram obtidos usando um coquetel de três projetada, sondas específicas ou um único teste individualmente. Isto levou a utilização de duas sondas separadas, específicas e a consideração dos resultados positivos como aqueles que são comuns a estas duas sondas. Finalmente, recomenda-se, portanto, no início do desenvolvimento do método, para melhores resultados e ser capaz de avaliar a especificidade dos resultados da puxar para baixo, para projetar 3 diferentes do oligonucleotide antisondas sentido e, em seguida, comparar experimentalmente sua eficiência, especialmente desde que a sonda eficiência pode ser alterada por preparação lisado celular. No entanto, o procedimento de sonda design baseado em modelagem de bioinformática do lncRNA secundário estrutura usamos permaneceu menos cara do que com base em piscinas de azulejos do oligonucleotide sondas2, e isso era menos demorado do que o método com base na sensibilidade de RNAse-H4.
Um controle negativo também deve ser realizado utilizando como oligonucleotide captura negativas ou o sentido DNA biotinilado do oligonucleotide probes ou mexidos pontas de prova do oligonucleotide, ou oligonucleotídeos dirigidos contra um RNA independente. Devido à existência de transcrições antisentido natural lncRNAs, uso de sondas de sentido do oligonucleotide às vezes pode ser inadequado. Independentemente da sonda do oligonucleotide seleccionada para o controlo negativo, é necessário verificar pela explosão que ele não cruzar com um conhecido do RNA e para manter em mente que este oligonucleotide pode cruzar para um lncRNA ainda un-anotado.
Os lisados celulares usados nesses experimentos suspenso de RNA foram obtidos a partir de 106 a 10 células de7 ao trabalhar com culturas de células e de 1 a 10 mg, ao trabalhar com tecido. A preparação de lisados celulares precisa ser adaptado de acordo com o tipo de tecido ou célula usado com duas etapas principais que devem ser otimizadas: ou seja, a etapa do cross-linking que permite a formação de ligações covalentes entre o lncRNA e seus parceiros moleculares e o passo sonication que reduz a viscosidade, fragmentando a cromatina.
O objetivo da etapa do cross-linking é garantir que todos os alvos de RNA permanecem fechados para o lncRNA, induzindo a formação de uma rede entre todos os parceiros moleculares. Uma etapa de tratamento de paraformaldeído que irá formar ligações covalentes entre o lncRNA e seus parceiros permite que a rede ser reticulado. No protocolo de gráfico, sugeriu-se trabalhando com lncRNA nuclear, para realizar um tratamento de primeira com paraformaldeído em toda célula lisado e um segundo tratamento sobre a fração de ácidos nucleicos isolado3,4. Observou-se que esta etapa complementar diminuíram a eficiência das sondas, provavelmente reduzindo a acessibilidade de lncRNA nas células. Portanto, o grau de reticulação por paraformaldeído tem de ser adaptadas tendo em conta a célula ou tecido tipo usado, a localização do lncRNA de interesse e a eficiência das sondas projetadas.
Enquanto a Lise das células, a cromatina é lançada no lisado e aumenta a sua viscosidade; é então necessário para destruir a cromatina pelo sonication para aumentar a fluidez das amostras e, consequentemente, facilitar a acessibilidade do oligonucleotide probes para o lncRNA de interesse. No entanto, sonication também irá destruir a RNA extraída com o lncRNA de interesse. É então importante para minimizar o tempo de sonication, de tal forma que enquanto eficiente reduz a viscosidade do lisado, também permite que a obtenção de RNA fragmentos com um comprimento compreendido entre 200-800 BP nota que o tempo de sonication será altamente depende tanto da quantidade e do tipo de tecido ou culturas de células utilizadas.
Em conclusão, o procedimento descrito aqui permite que em 2-3 dias a captura dos destinos de RNA de uma lncRNA desejado. Juntamente com o RT-qPCR, esses métodos permitirá à procura de uma associação específica e regulamento de um mRNA pelo lncRNA desejado como uma abordagem de candidato. Para uma abordagem de todo o genoma, experimentos suspenso de RNA podem ser analisados pela alta produtividade-a sequenciação do ARN que permite a recuperação de todos os RNAs associados a lncRNA desejada. Qualquer que seja a estratégia analítica escolhida, o procedimento suspenso do RNA deve fornecer novos conhecimentos significativos no Regulamento de RNA por lncRNAs.
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado pela Universidade de Aix-Marseille e CNRS e financiado por um subsídio de Laboratórios Pfizer.
Bioruptor Plus | Diagenode | B01020001 | Sonicator |
Dynabeads My One | Thermo-Fisher | 65001 | Magnetic streptavidin beads |
Formamide | Thermo-Fisher | 15515-026 | |
Gel electrophoresis apparatus | Advance | Mupid-One | Gel electrophoresis apparatus |
Proteinase K | Sigma | P2308 | |
RNA XS purification kit | Macherey-Nagel | 740902 | RNA purificationkit |
RNAseOUT | Thermo-Fisher | 10777-019 | RNAse inhibitor |
Trizol | Thermo-Fisher | 15596018 | RNA purification |
Tube Rotator | Stuart | SB2 | Eppendorf tube rotator |
RNA to DNA | Thermo-Fisher | 4387405 | Reverse transcription kit |
iTaq Universal SYBR Green Supermix | BioRad | 1725124 | qPCR reagent |
Applied 7500 Fast | Thermo-Fisher | 4351107 | qPCR apparatus |
Illumina TruSeq Stranded mRNA Sample Preparation kit | Illumina | 20020594 | DNA library construction kit |
Illumina NextSeq 500 | Illumina | SY-415-1002 | NGS system |