Aqui nós apresentamos um método experimental para testar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos.
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Artigo de método
Testando o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Multicópia plasmídeos são extremamente abundantes em procariontes, mas seu papel na evolução bacteriana continua a ser mal compreendido. Recentemente mostramos que o aumento no número de cópia do gene por célula fornecido por plasmídeos multicópia poderia acelerar a evolução dos genes codificados do plasmídeo. Neste trabalho, apresentamos um sistema experimental para testar a capacidade de plasmídeos multicópia para promover a evolução do gene. Utilizando métodos simples de biologia molecular, construímos um sistema de modelo onde um gene de resistência a antibióticos pode ser inserido em MG1655 de Escherichia coli , o cromossomo ou em um plasmídeo multicópia. Nós usamos uma abordagem de evolução experimental para propagar as diferentes estirpes sob concentrações crescentes de antibióticos e medimos a sobrevivência das populações bacterianas ao longo do tempo. A escolha da molécula do antibiótica e o gene de resistência é para que o gene só pode conferir resistência através da aquisição de mutações. Esta abordagem de "resgate evolutivo" fornece um método simples para testar o potencial de plasmídeos multicópia para promover a aquisição de resistência aos antibióticos. Na próxima etapa do sistema experimental, caracterizam-se as bases moleculares da resistência aos antibióticos. Para identificar as mutações responsável pela aquisição da resistência aos antibióticos, nós usamos a profundo sequenciamento de DNA das amostras obtidas a partir de clones e populações inteiras. Finalmente, para confirmar o papel das mutações no gene em estudo, podemos reconstruí-los em segundo plano parental e teste o fenótipo de resistência das cepas resultantes.
Introdução
Resistência aos antibióticos em bactérias é um problema de saúde1. Em um nível fundamental, a propagação da resistência aos antibióticos em bactérias patogênicas é um exemplo simples da evolução por seleção natural2,3. Simplificando, o uso de antibióticos gera a seleção de cepas resistentes. Dos principais problemas em biologia evolutiva, portanto, é compreender os fatores que influenciam a capacidade das populações bacterianas de desenvolver resistência aos antibióticos. Experimentos de seleção surgiram como uma ferramenta muito poderosa para investigar a biologia evolutiva das bactéri....
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Protocolo
1. construção do sistema Experimental de codificação de Gene de resistência aos antibióticos
Nota: Aqui MG1655 de Escherichia coli foi usado como a destinatário estirpe do gene de resistência aos antibióticos plasmídeo ou cromossomo-codificado. O gene de resistência aos antibióticos é codificado no cromossomo ou de um plasmídeo multicópia em uma cepa isogénicas caso contrário (Figura 1).
-
Inserção do gene da resistência aos antibióticos no λ do fago integração local (attB)20 do cromossomo de MG1655.
- Amplifica 500 bp-long regiões em a....
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Resultados
Em nosso trabalho anterior, a evolução do β-lactamase gene blaTEM-1 para conferir resistência para a terceira geração cefalosporina Ceftazidima12 foi investigada. Este gene foi selecionado porque, apesar de TEM-1 não confere resistência à Ceftazidima, mutações no blaTEM-1 podem ampliar o leque de atividade de TEM-1 para hidrolisar cefalosporinas como Ceftazidima29. As mutações em enzimas de resistência.......
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Discussão
Apresentamos um novo protocolo combinando a biologia molecular, evolução experimental e sequenciamento de DNA profundo visa investigar o papel de plasmídeos multicópia na evolução da resistência aos antibióticos em bactérias. Embora este protocolo combina técnicas de diferentes áreas, todos os métodos necessários para desenvolvê-la são simples e podem ser realizados em um laboratório de microbiologia regular. As etapas mais críticas no protocolo são provavelmente a construção de estirpes de sistema o modelo e a reconstru.......
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Divulgações
Os autores não têm nada para divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo Instituto de Salud Carlos III (plano Estatal de eu + D + eu 2013-2016): concede CP15-00012, PI16-00860 e CIBER (0053/CB06/02), co-financiado pelo Fundo Europeu Desenvolvimento Regional ' uma maneira de alcançar a Europa ' (FEDER). JAE é suportado pelo programa de atração de talento do governo da região de Madrid (2016-T1/BIO-1105) e a I + D de Excelencia de espanhol Ministerio de Economía, Industria y competitividade (BIO2017-85056-P). ASM é apoiado por uma bolsa de Servet Miguel do Instituto de Salud Carlos III (MS15/00012), co-financiado pelo Fundo Social Europeu "Investir no seu futuro" (FSE) e do FEDER.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Thermocycler | BioRad | C1000 | |
| Electroporator | BiorRad | 1652660 | |
| Cubetas de Electroporation | Sigma-Aldrich | Z706078 | |
| NanoDrop 2000/2000c | Thermo Fisher Scientific | ND-2000 | Determine a qualidade do DNA medindo as proporções de absorbância 260nm/280nm e 260nm/230nm |
| Incubadora | Memmert | UF1060 | |
| Incubadora (agitador) | Cole-Parmer Ltd | SI500 | |
| Fonte de alimentação de eletroforese | BioRad | 1645070 | Eletroforese em gel de agarose |
| Câmara de eletroforese | BioRad | 1704405 | Eletroforese em gel de agarose |
| Pipetas | Biohit | 725020, 725050, 725060, 725070 | |
| Pipetas | multicanalBiohit | 728220, 728230, 728240 | |
| Leitor de placas Synergy HTX | BioTek | BTS1LF | |
| Alças de inoculação | Sigma-Aldrich | I8388 | |
| Falcon | 351172 | ||
| LB | BD Difco | DF0446-17-3 | |
| LB ágar | Fisher scientific | BP1425-500 | |
| Phusion Polimerase | Thermo Fisher Scientific | F533S | |
| Gibson Assembly | New England Biolabs | E2611S | |
| Enzimas de resctricção | Fermentas FastDigest | ||
| Antibióticos | Sigma-Aldrich | ||
| QIAprep Spin Miniprep Kit | Qiagen | 27104 | Kit de extração de plasmídeo |
| Kit de purificação de DNA genômico Wizard | Kit de extração de gDNA | Promega | A1120 |
| DNeasy Blood & Kits de Tecidos | Qiagen | 69506 | kit de extração de gDNA |
| Cubetas de eletroporação | de Petri Z706078 | Sigma-Aldrich | |
| Sigma-Aldrich | D9054 | ||
| ClearLine | 390701 | ||
| (-80º | Thermo Fisher Scientific | 249945 | |
| QuantiFluor dsDNA System | Promega | E2670 | Quantificação do DNA concentartion |
| Agarose | BioRad | 1613100 | Eletroforese em gel de agarose |
| 50x tampão TAE | BioRad | 1610743 | Eletroforese em gel de agarose |
| T4 Polinucleotídeo quinase | Thermo Fisher Scientific | EK0031 | |
| T4 DNA Ligase | Thermo Fisher Scientific | EL0014 |
Referências
- Neill, J. TACKLING DRUG-RESISTANT INFECTIONS GLOBALLY: FINAL REPORT AND RECOMMENDATIONS. Review on Antimicrobal Resistance. , (2016).
- Palmer, A. C., Kishony, R. Understanding, predicting and manipulating the genotypic evolution of antibiotic resistance. Nat Rev Genet. 14 (4), 243-248 (2013).
- M....
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Reimpressões e permissões
