Cuantificación espacial de fármacos en lesiones de Tuberculosis pulmonar por Laser Capture Microdissection líquido cromatografía espectrometría de masas (LCM-LC/MS)
Summary
Aquí, describimos un protocolo usando el microdissection de la captura del laser juntada con el análisis por LC/MS para cuantificar espacialmente la distribución de drogas dentro de granulomas de la tuberculosis pulmonar. El enfoque tiene amplia aplicabilidad para cuantificar concentraciones de medicamentos en los tejidos de alto detalle espacial.
Abstract
La tuberculosis sigue siendo una causa importante de morbilidad y mortalidad en todo el mundo. Mejoras en los regímenes de fármacos existentes y el desarrollo de nuevas terapias son urgentemente necesarios. La capacidad de los medicamentos dosificados para alcanzar y para esterilizar bacterias dentro de regiones necróticas poco vascularizado (caseum) de granulomas pulmonares es crucial para la intervención terapéutica exitosa. Regímenes terapéuticos eficaces deben contener fármacos con propiedades de penetración de caseum favorable. Los métodos actuales de LC/MS para cuantificar los niveles de fármaco en tejidos biológicos tienen una limitada capacidad de resolución espacial, lo que dificulta determinar con exactitud las concentraciones de la droga absoluta dentro de los compartimientos pequeños de tejido como las que se encuentran dentro de granulomas necróticos. Aquí presentamos un protocolo con microdissection de la captura del laser (LCM) de regiones de tejido patológico distinto de cuantificación LC/MS. Esta técnica proporciona la cuantificación absoluta de drogas dentro de granuloma caseum, que rodea la lesión celular y tejido pulmonar y, por lo tanto, determina con exactitud si se están alcanzando concentraciones bactericidas. Además de la investigación de la tuberculosis, la técnica tiene muchas aplicaciones potenciales para cuantificar espacialmente resueltos de fármacos en los tejidos enfermos.
Introduction
La capacidad de resolver espacial y cuantificar niveles de drogas es un requisito crucial para determinar si los medicamentos contra la tuberculosis llegar a subpoblaciones bacterianas dentro de las lesiones pulmonares en concentraciones1de esterilización. De especial importancia es determinar penetración de drogas en la base necrótica de la lesión (llamada caseum), que normalmente contiene el mayor número de bacilos y puede acceso a los medicamentos debido a la ausencia de vascularización.
Los métodos tradicionales para evaluar la penetración de la lesión, que implican la homogeneización de las lesiones pulmonares suprimidas seguido de extracción por solvente y análisis de cromatografía líquida espectrometría de masas (LC/MS), son altamente sensibles y selectivos para las drogas de interés. Sin embargo, estos métodos ofrecen poca información espacial, limitado al tamaño del tejido homogeneizado original. Métodos de imagen basados en espectrometría de masa, como desorción del láser asistida por matriz (MALDI) de ionización2,3, desorción electrospray ionización (DESI)4 o extracción superficial mejorada de líquido5, 6 ofrecen capacidades de proyección de imagen altamente espacialmente resuelto, pero cuantificación directa puede ser extremadamente difícil o imposible debido a los efectos de supresión de iones heterogéneos y diferentes eficiencias de extracción del analito de la célula diferentes o7tipos de tejido. Además, más directa tejido MS imagen enfoques son inherentemente menos sensibles que la LC/MS debido a la falta de separación cromatográfica de especies endógenas que compiten por la ionización y la baja eficiencia de extracción por solvente de la droga del tejido.
Microdissection de la captura del laser (LCM) combinado con el análisis por LC/MS ha sido aplicada sistemáticamente para aislar y caracterizar regiones de distintos tejidos para estudios de proteómica8,9 y recientemente utilizados para la cuantificación de la droga en dosis tejidos animales10. Aquí presentamos un protocolo optimizado aplicando LCM combinado con el análisis por LC/MS (LCM-LC/MS) para cuantificar drogas anti-TB en compartimentos distintos granuloma. En el proceso de microdisección de captura láser, un láser UV se centra a través del objetivo de microscopio en la sección de tejido, que corta y aísla la zona de tejido deseada siguiendo una ruta definida por el usuario. Para LCM asistida por gravedad (la técnica utilizada para esta investigación), la sección del tejido se monta en una diapositiva de membrana de polímero delgada (PET o pluma) y el tejido es capturado en un tubo de tapón de colección situado debajo de la diapositiva. Las drogas se extraen del tejido suprimido y cuantificaron usando métodos estándar de la LC/MS. La cantidad de tejido necesaria para recogerse en última instancia depende de la concentración esperada de la droga presente en el tejido y la sensibilidad del método LC/MS. Para la mayoría de los análisis de drogas dosis niveles terapéuticos y analizados usando un espectrómetro de masas cuadrupolo triple rutina, 3 millones de μm2 (2de 3 mm) de tejido superficie es suficiente.
Este protocolo describe la poderosa combinación de perfil espacial y cuantificación completa ofrecido por LCM-LC/MS, proporcionando concentraciones de la droga absoluta en todos los compartimientos de granulomas TB. La técnica también puede aplicarse para determinar las concentraciones de drogas en muchos diversos tejidos enfermos proporcionando información de descubrimiento y desarrollo de medicamentos vitales.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cuantificación espacialmente resueltos de drogas dentro de las lesiones pulmonares de TB es necesaria para determinar si exposición alcanza concentraciones esterilización de poblaciones bacterianas que reside dentro de los compartimientos diferentes de la lesión. El método de LCM-LC/MS que se describe aquí permite la cuantificación absoluta de drogas anti-TB en todos los compartimientos de la lesión, incluyendo el caseum ricos en bacterias, usando solamente secciones de tejido de 1-3 en total. Homogeneización de…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Agradecemos a Paul O’Brien, Marizel Mina y Isabella Freedman para experimentos con animales, Jacquie Gonzalez y Danielle Weiner del NIH/NIAID para ayuda con la irradiación gamma de tejidos de conejo antes de microdisección de captura láser y Jansy Sarathy para manuscrito pensamientos y consejos. Este trabajo fue apoyado por fondos de la cuenta y Melinda Gates Foundation (OPP1174780) y la instrumentación de NIH compartido concesión de 1S10OD018072. Agradecemos a Eliseo A. Eugenin acceso al microscopio Leica LMD 6500 e intercambio de conocimientos y consejos. La compra y apoyo continuo, la 6500 de LMD fue financiado por la subvención del Instituto Nacional de Salud Mental, MH096625, Instituto Nacional de trastornos neurológicos y accidente cerebrovascular, NS105584, PHRI financiación (E.A.E) y GSK Aportesala (E.A.E).
Materials
| New Zealand White rabbits | Covance | N/A | |
| HN878 Mycobacterium tuberculosis | BEI Resources | NR-13647 | |
| Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N | Henry Schein Animal Health | 56344 | |
| Anased (Xylazine) 100 mg/mL | Henry Schein Animal Health | 33198 | |
| Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution | Virbac | 710101 | |
| Acetonitrile (LC-MS grade) | Fisher | A955-212 | |
| Methanol (LC-MS grade) | Fisher | A456-212 | |
| Formic Acid (LC-MS grade) | Fisher | A117-50 | |
| Water (LC-MS grade) | Fisher | W6212 | |
| 0.2 mL flat-cap PCR tubes | Corning | 07-200-392 | |
| Steel frames, PET-membrane | Leica | 11505151 | |
| Premium Frosted Microscope Slides | Fisher | 12-544-2 | |
| 96 Deep well plate 2.0ML PP RB | Fisher | NC0363259 | |
| Zorbax SB-C8 column (4.6 by 50 mm; particle size, 3.5 μm) | Agilent | 820631-001D | |
| "Zipper” Seal Sample Bags | Fisher | 01-816-1B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Equipment | |||
| CM1850 cryostat | Leica | Discontinued | Leica CM1860 is the current model |
| Laser Microdissection System 6500 | Leica | Discontinued | Leica LMD 6 is the current model |
| Agilent 1260 Infinity II HPLC | Agilent | ||
| API 4000 QTRAP Mass Spectrometer | Sciex |
Referências
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