Enquête sur le recrutement de protéines aux lésions de l’ADN à l’aide de 405 Nm Laser Micro-irradiation
Summary
Étude cinétique de réparation des dommages ADN nécessite un système d’induire des lésions à des régions sub nucléaires définies. Les auteurs décrivent une méthode pour créer des sauts de double-brin localisées à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser équipé d’un laser à 405 nm et fournir des procédures automatisées afin de quantifier la dynamique des facteurs de réparation à ces lésions.
Abstract
La réponse de dommages ADN (DDR) utilise une pléthore de protéines pour détecter, signaler et réparer les lésions de l’ADN. Délimiter cette réponse est essentiel de comprendre les mécanismes de maintien du génome. Recrutement et échanges de protéines à des lésions étant très dynamiques, leur étude nécessite la capacité de générer des dommages à l’ADN de façon rapide et dans l’espace délimité. Nous décrivons ici les procédures pour induire localement des lésions de l’ADN dans les cellules humaines à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser couramment disponible équipé d’un faisceau de 405 nm. Accumulation de maintenance du génome à rayures de laser peut être évaluées par immunofluorescence (IF) ou en temps réel à l’aide de protéines fluorescents reporters le tag. À l’aide de phosphorylés histone H2A. X (γ-H2A.X) et Replication Protein A (RPA) comme marqueurs, la méthode fournit une résolution suffisante pour distinguer les facteurs recrutés localement de celles qui se propagent sur la chromatine adjacente. Nous fournir également des scripts basés sur ImageJ pour surveiller efficacement la cinétique de la relocalisation de la protéine à ADN endommagent des sites. Ces améliorations simplifient grandement l’étude de la dynamique de la DDR.
Introduction
Les cellules sont constamment exposés à des sources de dommages à l’ADN endogènes et exogènes qui menacent leur intégrité génomique. Le DDR est un ensemble de voies que détecter et réparer les lésions de l’ADN pour maintenir la stabilité du génome de signaux de signalisation. Cassures double-brin d’ADN (CDB), le DDR se produit principalement sur les deux plateformes complémentaires : γ-H2A.X-étiqueté de la chromatine et une région d’ADN (ADN simple brin) simple brin réséquée généralement recouvertes d’ADNsb-liaison complexe Apr1,2.
UV-laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec la thymidine analogique 5-bromo-2′ désoxyuridine (BrdU) ou la teinture d’ADN bisbenzimide éthylate TRIHYDROCHLORURE (BBET, Hoechst 33342) crée un mélange de lésions de l’ADN y compris cassures simple brin ( BSN) et CDB qui suscitent un DDR localisé sur la chromatine et ADN simple brin plates-formes3,4. Des travaux antérieurs ont montré que recrutement des facteurs d’entretien de génome de ces deux plateformes distinctes à ORD peut être distinguée en utilisant des lasers de haute énergie UV-A (335-365 nm) combinés avec IF2,5. Microscopes équipés de ces lasers sont coûteuses car elles nécessitent un laser à haute énergie et dédiés objectifs transmission UV-A, ce qui les rend beaucoup moins répandue dans les milieux universitaires et pharmaceutiques que les microscopes confocaux à balayage laser avec laser à 405 nm lignes. L’étude du recrutement de protéines et d’échange sur les sites de micro-irradiés s’oppose également à l’analyse d’image manuel laborieux pour décrire le comportement dynamique des facteurs d’entretien de génome.
Ici, nous montrons que la sensibilisation préalable des cellules avec des taches d’acide nucléique BrdU ou BBET suivie par micro-irradiation utilisant un laser à 405 nm sur un microscope confocal commun permet de contrôler la dynamique de facteur de maintenance du génome aux lésions de l’ADN. À l’aide de γ-H2A.X ou sous-unités complexes de l’armée patriotique rwandaise comme marqueurs de la plate-forme avec empilement z pour une plus grande profondeur de champ et déconvolution pour une résolution améliorée permet l’expérimentateur de discriminer les facteurs qui sont recrutés localement à la CDB de celles qui se propagent à domaines de chromatine grand entourant la lésion initiale. Cette sous-classification selon différents compartiments intra nucléaires contribue à affiner les rôles possibles des protéines non caractérisés recrutés aux sites de micro-irradié. En outre, nous fournissons des protocoles pratiques et optimisée des pipelines pour rapidement analyser la dynamique des facteurs d’entretien de génome en utilisant le logiciel open-source Fidji (une distribution de ImageJ)6,7,8. Ces raffinements aux méthodes actuelles de micro-irradiation de l’étude du processus de DDR rendent possible dans pratiquement n’importe quel arrangement de laboratoire.
Protocol
Representative Results
Discussion
Utilisant les méthodes décrites ci-dessus, 405 nm laser micro-irradiation des cellules pré sensibilisées avec BBET ou BrdU permet la génération localisée des lésions de l’ADN dont la CDB dans le noyau des cellules humaines adhérentes. Cinétique de DDR à ces DSBs sont similaires à ceux générés avec d’autres méthodes dans les cellules eucaryotes9,18,19. Résection de DSB sur les sites de micro-irradié mène à…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches [subvention à la découverte 5026 à a.M] et par une nouvelle génération de bourses d’études scientifiques de la société de recherche du Cancer [21531 à a.M]. Nous remercions m. Jean-François Lucier fournissant l’excellent contrôle de la qualité des scripts Python de Fidji et conseils sur l’analyse statistique. Nous remercions le Dr. Stephanie A. Yazinski pour la recette de solution de fixation IF. Nous remercions Paul-Ludovic Karsenti de l’aide avec les mesures de puissance laser.
Materials
| Olympus FLUOVIEW FV3000 resonant laser scanning confocal microscope | Olympus | ||
| FluoView FV3000 software (version 2.1) | Olympus | ||
| 405 nm laser | Coherent | Radiation source | |
| Microscope incubator AIO-UNO-OLYUS-1 | Okolab | OKO-UNO-1 | |
| 60X /1.4 Objective | Olympus | Oil immersion objective | |
| 8-well culture slides on coverglass (X-well) | Sarstedt | 94.6190.802 | |
| U2OS osteosarcoma human cell line | ATCC | HTB-96 | Stable cell lines |
| 4’,6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) | ThermoFisher | D1306 | Caution toxic |
| 5-bromo-2′-deoxyuridine (BrdU) | Sigma-Aldrich | 59-14-3 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | Caution toxic |
| Bisbenzimide H 33342 (Hoechst 33342) | ThermoFisher | 62249 | |
| Bovine serum albumin (BSA) | ThermoFisher | BP1600-100 | |
| Trypsin EDTA 0.1% | ThermoFisher | 15400-054 | |
| Triton X-100 | BioShop | TRX777.100 | |
| Tween-20 | ThermoFisher | BP337-500 | |
| Sucrose | BioShop | SUC507 | |
| JetPRIME transfection reagent | Polyplus | 114-07 | |
| ProLong Diamond Antifade mountant with DAPI | ThermoFisher | P36962 | |
| DMEM 1X, + phenol red | Wisent | 319-005-CL | |
| DMEM 1X, – phenol red | Wisent | 319-051-CL | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Wisent | 080-150 | |
| Mouse anti-RPA32 antibody | Abcam | ab2175 | 1:500 for IF |
| Rabbit anti-γ-H2A.X antibody | Cell Signaling | 9718S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-53BP1 antibody | Cell Signaling | 4937S | 1:500 for IF |
| Rabbit Anti-PRP19 antibody | Abcam | ab27692 | 1:500 for IF |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa Fluor 647 | Cell Signaling | 4414S | 1:250 for IF |
| Goat anti-mouse IgG Alexa Fluor 488 | Cell Signaling | 4408S | 1:250 for IF |
| Fiji image analysis open-source software | https://fiji.sc | ||
| 1918-K Power meter with a 918D-SL-0D3 sensor | Newport |
Referências
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