Apresentamos um protocolo para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Seus perfis de mineralização foram analisados por alizarina Red-S (AR-S) coloração, visualização de luz ultravioleta (UV), imagem de microscopia eletrônica (TEM) de transmissão e microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX).
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Artigo de método
Análise de minerais produzidos por hFOB 1.19 e Saos-2 células usando microscopia eletrônica de transmissão com energia dispersiva microanálise de raios-x
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este vídeo apresenta o uso da microscopia eletrônica de transmissão com microanálise de raios-x energia dispersiva (EDX-TEM) para comparar o estado de minerais em vesículas lançadas por duas linhas de células de osso humano: hFOB 1.19 e Saos-2. Estas linhas de celular, após o tratamento com ácido ascórbico (AA) e β-glicerofosfato (β-GP), submetido a completa transdiferenciação celular osteogênico de proliferação de mineralização e produzir vesículas de matriz (MVs) que desencadeiam a nucleação de apatita na matriz extracelular (ECM).
Com base na coloração de vermelho de alizarina-S (AR-S) e análise da composição dos minerais em lisados celulares usando luz ultravioleta (UV) ou em vesículas utilizando imagens TEM seguida por íon mapeamento e quantificação de EDX, podemos inferir que osteossarcoma Saos-2 e osteoblásticas células hFOB 1.19 revelaram perfis distintos de mineralização. SAOS-2 células mineralize mais eficientemente do que as células hFOB 1.19 e produzem maiores depósitos minerais que não são visíveis sob luz UV, mas são semelhantes a hidroxiapatita (HA), em que eles têm mais Ca e F substituições.
Os resultados obtidos com estas técnicas nos permitem concluir que o processo de mineralização difere dependendo do tipo de célula. Propomos que, a nível celular, a origem e as propriedades das vesículas predeterminar o tipo de minerais.
Introdução
Osso é um tipo de tecido conjuntivo composto de duas partes: orgânico (células e fibras colágenas) e mineral (compostos de cálcio e fosfato). Os principais componentes minerais nos ossos são apatites1. Diferentes tipos de células competentes de mineralização no osso (osteoblastos), dentes (odontoblastos) e cartilagem (condrócitos) regulam os passos iniciais da mineralização através da produção de proteínas da matriz extracelular (ECM) e liberando a matriz vesículas (MVs) (Figura 1). MVs são vesículas de diâmetro de nm de 100-300 que acumulam cálcio e fosfato, facilitando a nucleação de apatita e posteriormente vinc....
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Protocolo
1. cultura e tratamento da pilha
- Coloque todo o material necessário, sob a capa de fluxo laminar e esterilizá-los sob luz UV. Os meios de cultura são: uma mistura 1:1 de presunto é mídia F12 e DMEM com 2,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL estreptomicina, 0,3 mg/mL G418 e 10% de soro Fetal bovino (FBS) (v/v) para antígeno grande do T de feto humano hFOB 1.19 SV40 transfectadas osteoblastos e meio de 5A McCoy com 1,5 mM L-glutamina suplementado com 100 penicilina U/mL, 100 U/mL Estreptomicina e 15% FBS (v/v) para as células humanas osteossarcoma Saos-2.
- Cultura de células hFOB 1.19 34 ° c numa atmosfera de 5% de CO2<....
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Resultados
Temperatura-EDX permite obter a imagem em vitro das vesículas de matriz (MVs) lançadas pela mineralização de células e de minerais produzidos por Mvs. os resultados obtidos usando esta técnica demonstram que o processo de mineralização pode proceder de forma diferente em vários tipos de células. As linhas de duas células receberam o mesmo tratamento de transdiferenciação celular osteoblástica, ainda estimulados Saos-2 células mais eficientemente do que hFOB mineralizado .......
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Discussão
No jornal atual, descrevemos os protocolos de coloração, identificação de luz UV de fluorapatita AR-S e TEM-EDX em vitro imagem de MVs lançados pela mineralização de células e de minerais produzidos por MVs. É possível abordar todos os métodos mencionados acima, seguindo algumas etapas de solução de problemas comuns. A fim de obter resultados óptimos, vários passos críticos devem ser realizados com cuidado. Primeiro, é melhor adicionar AA (que é ácida) seguido por β-GP (que é alcalino) para preservar o .......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm nenhum conflito de interesses.
Agradecimentos
MK e ASK executadas operações manuais e LB preparou desenhos e fez o filme. ASK escreveu o manuscrito, LB escreveu o roteiro e MK preparou a mesa. SM, RB e SP ler criticamente a tabela, o script e o manuscrito. Os autores gostaria de agradecer a Hanna Chomontowska pela sua excelente assistência com Ultramicrotomia bem como Szymon Suski e Henryk Bilski pela excelente assistência com análise TEM-EDX. Os autores gostaria de agradecer o dr Patrick bosques para correção profissional de língua inglesa e Barbara Sobiak para gravar as instruções.
Este trabalho foi apoiado pela concessão N N401 140639 do Ministério da ciência e do ensino superior po....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Reagente | |||
| Presunto' s Mistura de mídia DMEM/F12 | PAA | E15-813 | 1:1, para feto humano hFOB 1.19 SV40 osteoblastos transfectados com antígeno T grande (ATCC CRL-11372) |
| McCoy' s 5A PAA | E82312-0025 | médio para células Saos-2 de osteossarcoma humano (ATCC HTB-85) | |
| Mistura de antibióticos (penicilina/estreptomicina) | Sigma | P0781-100ML | 100 U/mL cada |
| G-418 | Sigma | 68168 | 0,3 mg/mL |
| FBS | Gibco | 10270 | 10% para hFOB 1,19 e 15% para Saos-2 |
| AA | Sigma | A-5960 | 50 µ g / mL |
| ß-GP | Sigma | G9422-100G | 7,5 mM |
| Bio-Gel HTP Gel | Bio-Rad | 130-0420 | para HA |
| FA | sintetizado por nós | ||
| CA | sintetizado por nós | ||
| Tampão de fosfato de sódio Na2< / sub>HPO4< / sub> / NaH < sub>2< / sub>PO4< / sub> mistura | Sigma | S7907 / S8282 | 0,1 M, pH 7,2 |
| PBS | pH 7,0, preparado por nós | ||
| AR-S em PBS | Sigma | A5533-25G | 0,5 g / 100 mL, pH 5,0 |
| Colagenase tipo IA | Sigma | C2674 | 500 U / mL |
| Tampão | preparado por nós | ||
| Água deionizada | produzida por nós | ||
| Etanol | POCh | BA6480111 | absoluto 99,8% e soluções 25, 50, 75, 90% |
| Acetato de uranila em 50% de etanol | Polysciences Inc. | 21447-25 | 0,25 g/10 mL |
| PD meio | pH 7,4, preparado por nós | ||
| Mistura de fixação (paraformaldeído/glutaraldeído) | Sigma | 158127/G-6257 | 3%:1% |
| Pós-fixação OsO4 | Sigma | 75633 | 1% |
| LR Resina branca em etanol | Polysciences Inc. | 17411-MUNC 500g | 1:2, 1:1, 100% |
| Acetona | CHEMPUR | 111024800 | puro |
| Ferramenta | |||
| Criogênico Frascos | Corning Inc. | 430487 | plástico de 1,2 mL |
| Falcon | 353003 | 100 mm | |
| Falcon | 352096 e 352070 | 15 e 50 mL | |
| Falcon | e VWR | 357521 e 612-3700 | plástico de 1 e 10 mL |
| Sigma | Z688312 e Z628034 | 1,5 mL preto e 2 mL transparente | |
| Pontas de plástico | VWR | 613-0364, 613-0239 e 613-1050 | 0.1-10 µ L natural, 1-200 µ L amarelo e 200-1000 µ L azul |
| Racks de plástico | Light Labs | A-7055-Z, A-7053-C | verde para tubos, laranja para microtubos e azul para sondas TEM |
| Laminar Hera Save | Thermo Scientific Co. | Filtro KS12 | HEPA (H14 de acordo com DIN EN 1822) |
| Incubadoras Hera Cell | Thermo Scientific Co. | 150 | 34° C para hFOB 1,19 e 37° C para Saos-2 |
| Hotte | POLON | WCS-2 | para colorações TEM |
| Garrafas de vidro | SIMAX | 1632414501050 e 1632414501100 | 50 e 100 mL |
| Tubos de vidro de quartzo | SIMAX | 638422010100 | Ø 10 mm, L 100 mm |
| Bomba | IBS Integra Biosciences | VACUSAFE conforto | para vácuo |
| Forno | Memmert | UNE 400 | 56° C |
| Placa multipoços de porcelana | Rosenthal technik | 229/12 | 12 poços |
| Copos de vidro | SIMAX | 632417010025 | 25 mL |
| Garrafas de vidro | Pocord | DIN22 | 10 mL |
| Caixa de plástico | Agar Scientific Ltd. | para a escuridão | |
| Snap Fit Cápsulas de Gelatina | Agar Scientific Ltd. | G3741 | tamanho 1 |
| Formvar / Carbono 300 Mesh Ni grades na caixa | Agar Scientific Ltd. | Filme S162N3 | no lado brilhante |
| Raspador de células de silício | Sigma | SIAL0010-100EA | tamanho 1,8/25 cm |
| Seringa com agulha | Seringa BogMark | 007 | 1 mL 40 U, agulha 0,5 x 16 |
| Seringa | Chirana | CH005L | Centrífuga de 5 mL |
| MPW | Medical Instruments | MPW-350R | 130 x g e 500 x g |
| transiluminador UV | UVP | M-20 | para luz visível e UV |
| Ultramicrótomo | LKB | NOVA | 700Å seções |
| Suporte de bloco | LKB | E6711 | forma redonda |
| Faca de diamante | DiATOME | Ultra 45° | tamanho 3 |
| Porta-pestanas | bovino, preparado por nós | ||
| Fórceps | ROTH | 2855.1 | antiestático para grelhas |
| Conjunto de espátulas | ROTH | E286.1 | antiestático para pós |
| Imagem | |||
| Microscópio de Luz Invertida | Zeiss com Canon | AxioObserver Z1 equipado com PowerShot G9 | Contraste de fase, luz transmitida, 20 x objetiva, filtros RGB |
| Microscópio Eletrônico de Transmissão | TEM Jeol Co. com Oxford Instruments e SiS-Olympus | JEM-1400 TEM equipado com sistema de microanálise de raios X (EDX) por dispersão de energia INCA de gama completa e ampliação de câmera MORADA G2 de 11 megapixels | 50.000X para TEM e 15.000X para STEM e EDX |
| Corpo da câmera e lentes | Nikon | Nikon D7100 Nikkor AF Micro 105 mm f/2.8D Nikkor AF-S 50 mm f/1.8G Nikkor AF 28 mm f/2.8D | para gravações de filmes |
| Microfone | MXL Mics | Tempo | para gravações de voz |
Referências
- Buckwalter, J. A., Cooper, R. R. Bone structure and function. Instr. Course Lect. 36, 27-28 (1987).
- Anderson, H. C. Molecular biology of matrix vesicles. Clin. Orthop. Relat. Res. 314, 266-280 (1995).
- Anderson, H. C. Matrix v....
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Reimpressões e permissões
