طرق "كشف السامة للخلايا أميلويدس التالية العدوى من الرئة خلايا بطانية" الزائفة الزّنجاريّة
Summary
وترد أساليب بسيطة لما أبدته من إنتاج أميلويدس السامة للخلايا بعد إصابة بطانة الرئوية الزائفة الزّنجاريّة.
Abstract
المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي أعقبت التخريج من المستشفى. قد تم الافتراض بأن العدوى للأنسجة الرئوية أثناء الالتهاب الرئوي يؤدي إلى إنتاج cytotoxins المعمرة التي يمكن أن تؤدي إلى فشل اللاحقة نهاية الجهاز. وقد وضعنا في المختبر فحوصات لاختبار الفرضية القائلة بأن تنتج cytotoxins أثناء الإصابة الرئوية. تستخدم الخلايا غشائي الرئة الفئران المعزولة وبكتيريا الزائفة الزّنجاريّة كنظم نموذجية، وإنتاج سيتوكسينس بعد الإصابة بالخلايا البطانية من البكتيريا هو أثبت استخدام زراعة الخلايا التي تليها كوانتيتيشن المباشر باستخدام فحوصات نازعة لاكتات وطريقة مجهرية جديدة استخدام تكنولوجيا إيماجيج. كان تبين طبيعة هذه cytotoxins اميلويد فحوصات ملزمة تي ثيوفلافين وإيمونوبلوتينج وإيمونوديبليشن باستخدام الأجسام المضادة اميلويد A11. أظهرت تحليلات أخرى باستخدام إيمونوبلوتينج أن تاو oligomeric و Aβ أنتجت وصدر عن خلايا بطانية بعد الإصابة من P. الزّنجاريّة. يجب أن تكون هذه الطرق القابلة للتكييف وفقا لتحليلات للعينات السريرية البشرية.
Introduction
المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر التي تلت المستشفى تصريف1،2،،من34،،من56. وفي معظم الحالات، تحدث الوفاة بنوع من الفشل نهاية الجهاز بما في ذلك الكلي، الرئة، القلب، أو أحداث الكبد، فضلا عن السكتة الدماغية5،6. والسبب في ارتفاع معدل الوفيات في هذا المريض السكان أنشأ ابدأ.
ويصنف الالتهاب الرئوي أما يجري اكتسب المجتمع أو المكتسبة في المستشفى (المستشفيات)، والعوامل التي يمكن أن تسبب الالتهاب الرئوي وتشمل البكتيريا والفيروسات والفطريات والمواد الكيميائية. واحد من الأسباب الرئيسية لالتهاب رئوي المستشفوي هو بكتيريا الزائفة الزّنجاريّة. P. الزّنجاريّة هو كائن الغرام الذي يستخدم نظام إفراز نوع الثالث لنقل مختلف الجزيئات المستجيب، يسمى اكسونزيميس، مباشرة إلى السيتوبلازم للخلايا الهدف7،8. خلال عدوى خلايا غشائي الرئة، اكسونزيميس استهداف مختلف البروتينات داخل الخلايا، بما في ذلك شكل من أشكال بطانية من البروتينات المرتبطة microtubule تاو9،10،11،12 ، مما أدى إلى انهيار حاجز غشائي الناتجة في ذمة رئوية حادة، انخفضت وظائف الرئتين، وفي كثير من الأحيان، الموت.
وكما ذكر سابقا، المرضى الذين ينجون من الالتهاب الرئوي الأولى يكون ارتفاع معدلات الوفاة في الأشهر ال 12 الأولى بعد التخريج من المستشفى. إليه ممكنة لتفسير هذه الظاهرة هو أن يتم إنشاء نوع من السمية طويلة الأمد خلال العدوى الأولية التي تؤدي إلى سوء نتائج طويلة الأجل. ملاحظتان تدعم هذه الإمكانية. تفشل خلايا غشائي الرئة أولاً، مثقف التي تعامل في البداية مع P. الزّنجاريّة تنتشر لتصل إلى أسبوع بعد قتل البكتيريا بالمضادات الحيوية من13. ثبت البريونات ثانيا، المعمرة والوكلاء مع الخصائص بريون في مختلف الأمراض البشرية والحيوانية، لا سيما الأمراض المرتبطة بال14،العصبي15.
وقد وصف أساليب لدراسة إمكانية إنتاج العوامل السامة للخلايا المعمرة خلال العدوى الرئوية ابدأ. ويرد هنا سلسلة من فحوصات بسيطة في المختبر التي يمكن استخدامها للتحقيق في إنتاج سيتوتوكسين والنشاط بعد الإصابة باستخدام مشتركة الالتهاب رئوي تسبب عامل, P. الزّنجاريّة. ينبغي أن تكون هذه الاختبارات القابلة للتكييف وفقا للتحقيق التعريفي سيتوتوكسين ممكن بعد الإصابة باستخدام العوامل الأخرى التي تسبب الالتهاب الرئوي، وسوبيرناتانتس التي يتم إنشاؤها أيضا ينبغي أن تكون مفيدة للتحقيق في آثار سيتوتوكسينس في الجامعة الأجهزة أو الحيوانات. أخيرا، سوف تكون الاختبارات التي ترد هنا على الأرجح قابلة للتكيف لاختبار السوائل البيولوجية الحيوانية والبشرية لإنتاج cytotoxins أثناء الالتهاب الرئوي.
Protocol
Representative Results
Discussion
وترد أساليب بسيطة في المختبر هنا، التي تسمح بالمظاهرات لتوليد أميلويدس السامة للخلايا أثناء الإصابة بالالتهاب رئوي التسبب في الكائن الحي. وتشمل هذه الأساليب خلية ثقافة الإنزيم سيتوتوكسيسيتي، إيمونوبلوتينج، كوانتيتيشن خلية القتل باستخدام الأسلوب المجهري الرواية، وربط تي إتش تي. أ?…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
كان تمويل هذه البحوث في أجزاء من منح المعاهد الوطنية للصحة HL66299 للملخص والممولة من الميزانية العادية و SL، HL60024 للملخص، و HL136869 بوسط.
Materials
| Rabbit anti beta amyloid | Thermo | 71-5800 | |
| A11 amyloid oligomer antibody | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anti-tau oligomer antibody | EMD Millipore | ABN454 | |
| Thioflavin T | Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| 0.22 micron syringe filters | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Goat antirabbit IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Strains PA103 and ΔPcrV | These strains of P. aeruginosa were obtained from Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectin | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectin | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0.22 micron nitrocellulose | BioRad | 162-0112 | |
| Type 2 collagenase | Worthington | LS004176 | |
| Fetal bovine serum | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicillin Disodium salt | Sigma | C1389 | |
| Microcetrifugation concentrators- 10,000 MW cut-off | Millipore | UFC801008 | |
| Potassium phosphate dibasic | Sigma | 795496-500G | |
| Magnesium phosphate heptahydrate | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Citric Acid | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Sodium phosphate dibasic heptahydrate | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Automated Cell Counter | Invitrogen | C10277 |
Referências
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man’s friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F. Factors of importance for the long-term prognosis after hospital treated pneumonia. Thorax. 48 (8), 785-789 (1993).
- Meier, C. R., Jick, S. S., Derby, L. E., Vasilakis, C., Jick, H. Acute respiratory tract infections and risk of first-time acute myocardial infarction. Lancet. 351 (9114), 1467-1471 (1998).
- Waterer, G. W., Kessler, L. A., Wunderink, R. G. Medium-term survival after hospitalization with community-acquired pneumonia. Am J Resp Crit Care Med. 169 (8), 910-914 (2003).
- Yende, S., et al. Inflammatory markers at hospital discharge predict subsequent mortality after pneumonia and sepsis. Am J Resp Crit Care Med. 177 (11), 1242-1247 (2008).
- Corrales-Medina, V. F., et al. Association between hospitalization for pneumonia and subsequent risk of cardiovascular disease. J Am Med Assoc. 313 (3), 264-274 (2015).
- Frank, D. W. The exoenzyme S regulon of Pseudomonas aeruginosa. Mol Microbiol. 26 (4), 621-629 (1997).
- Engel, J., Balachandran, P. Role of Pseudomonas aeruginosa type III effectors in disease. Curr Opin Microbiol. 12 (1), 61-66 (2009).
- Ochoa, C. D., Alexeyev, M., Pastukh, V., Balczon, R., Stevens, T. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y is a promiscuous cyclase that increases endothelial tau phosphorylation and permeability. J. Biol. Chem. 287 (30), 25407-25418 (2012).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells. PLoS One. 8, e74343 (2013).
- Morrow, K. A., et al. Pseudomonas aeruginosa exoenzymes U and Y induce a transmissible endothelial proteinopathy. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 310 (4), L337-L353 (2016).
- Balczon, R., et al. Pseudomonas aeruginosa infection liberates transmissible, cytotoxic prion amyloids. FASEB Journal. 31 (7), 2785-2796 (2017).
- Stevens, T. C., et al. The Pseudomonas aeruginosa exoenzyme Y impairs endothelial cell proliferation and vascular repair following lung injury. Am J Physiol Lung Cell Molec Physiol. 306 (10), L915-L924 (2014).
- Prusiner, S. B. Creutzfeldt-Jakob disease and scrapie prions. Alzheimer Dis Assoc Disord. 3 (1-2), 52-78 (1989).
- Hunter, N. Scrapie: Uncertainties, biology, and molecular approaches. Biochem. Biophys. Acta. 1772 (6), 619-629 (2007).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvasc Res. 67 (2), 139-151 (2004).
- Marmont, L. S., et al. Oligomeric lipoprotein PelC guides Pel polysaccharide export across the outer membrane of Pseudomonas aeruginosa. Proc Natl Acad Sci USA. 114 (11), 2892-2897 (2017).
