Métodos simples são descritos para demonstrar a produção de amiloides citotóxicos após infecção do endotélio pulmonar por Pseudomonas aeruginosa.
É necessária uma assinatura do JoVE para visualizar este conteúdo. Faça login ou inicie seu teste gratuito.
Artigo de método
Métodos para detecção de citotóxicos amiloides seguir infecção de pulmonar células endoteliais por Pseudomonas aeruginosa
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses após a alta hospitalar. Isso tem sido a hipótese de que a infecção do tecido pulmonar durante uma pneumonia resulta na produção de citotoxinas long-lived que podem levar ao fracasso subsequente fim órgão. Nós desenvolvemos em vitro ensaios para testar a hipótese que citotoxinas são produzidas durante a infecção pulmonar. As células endoteliais pulmonar isolado de rato e a bactéria Pseudomonas aeruginosa são usados como sistemas modelo, e a produção de cytoxins após a infecção das células endoteliais por bactérias é demonstrada usando cultura de células, seguida por quantificação directa utilizando ensaios de lactato desidrogenase e um novo método microscópico utilizando tecnologia ImageJ. A natureza amiloide destas citotoxinas foi demonstrada por ensaios de thioflavin T obrigatórios e immunoblotting e immunodepletion usando anticorpo antiamilóide de A11. Novas análises usando immunoblotting demonstraram que tau oligoméricas e Aβ foram produzidos e liberados por células endoteliais após infecção por p. aeruginosa. Esses métodos devem ser facilmente adaptávelas para análises de amostras clínicas humanas.
Introdução
Pacientes que sobrevivem a pneumonia tem elevadas taxas de mortalidade nos meses seguintes hospital descarga1,2,3,4,5,6. Na maioria dos casos, a morte ocorre por algum tipo de falha final-órgão, incluindo renais, pulmonares, cardíacas, ou eventos de fígado, bem como derrame5,6. A razão para a elevada taxa de mortalidade nesta população de pacientes nunca foi estabelecida.
Pneumonia é cla....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Protocolo
Todos os procedimentos de animais foram revisados e aprovados pelo Comitê de cuidado Animal da Universidade do Sul do Alabama e institucional e foram realizados em conformidade com todas as regulamentações federais, estaduais e locais. Culturas primárias de rato pulmonar microvascular células endoteliais (PMVECs) foram obtidas da instalação de núcleo de cultura de célula Center da Universidade do Sul do Alabama para biologia do pulmão. As células foram preparadas usando os procedimentos descritos anteriormente16.
1. geração de sobrenadantes citotóxicos
Nota: Aqui, usamos dois diferentes cepa....
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Resultados
Um ensaio simples em vitro foi desenvolvido para ensaio para a presença de citotoxinas em sobrenadantes de células infectadas com a bactéria p. aeruginosa. Basicamente, meio de cultura de células infectadas é coletado 4 h após a adição de bactérias, as bactérias são removidas pela esterilização do filtro do sobrenadante da cultura, e em seguida o sobrenadante estéril é adicionado a uma nova população de células. As células são então observadas 21-24 h após a adição do so.......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Discussão
Aqui, simples em vitro métodos estão descritos que permitem a demonstração da geração de amiloides citotóxicas durante a infecção com uma organismo causador de pneumonia. Estes métodos incluem um ensaio de citotoxicidade de cultura de células, immunoblotting, quantificação de célula usando um novo método microscópico e ThT vinculação a matar. Análises dos agentes citotóxicos têm demonstrado que eles são amiloide na natureza (Figura 2 e Figura .......
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Divulgações
Nenhum relatório.
Agradecimentos
Esta pesquisa foi financiada em partes por subvenções de NIH HL66299 TS, RB e SL, HL60024 de TS e HL136869 para MF.
....Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Anticorpo anti-oligômero amilóide | Thermo | 71-5800 | |
| A11 | StressMarq | SPC-506D | |
| T22 anticorpo anti-oligômero tau | EMD Millipore | ABN454 | |
| Tioflavina | T Sigma Aldrich | T3516 | |
| HBSS | Gibco | 14025-092 | |
| PBS | Gibco | 10010-023 | |
| filtros de seringa de 0,22 mícrons | Millipore | SLGP033RS | |
| DMEM | Gibco | 11965-092 | |
| HRP Cabra anticoelho IgG | Abcam | ab6721-1 | |
| Cepas PA103 e Δ PcrV | Essas cepas de P. aeruginosa foram obtidas do Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI | ||
| FITC Griffonia lectina | Sigma Aldrich | L9381 | |
| TRITC Helix pomatia lectina | Sigma Aldrich | L1261 | |
| Agar | Fisher | BP1423-500 | |
| 0,22 mícron nitrocelulose | BioRad | 162-0112 | |
| Colagenase tipo 2 | Worthington | LS004176 | |
| Soro fetal bovino | Hyclone | SH30898.03IH | |
| PenStrep | Gibco | 15070063 | |
| Carbenicilina Sal dissódico | Sigma | C1389 | |
| Concentradores de microcetrifugação - corte de 10.000 MW | Millipore | UFC801008 | |
| Fosfato de potássio dibásico | Sigma | 795496-500G | |
| Fosfato de magnésio heptahidratado | MP Biomedicals | MP021914221 | |
| Ácido cítrico | G Biosciences | 50-103-5801 | |
| Fosfato de sódio dibásico heptahidratado | Sigma | S9506-500G | |
| Countess Contador de células automatizado | Invitrogen | C10277 |
Referências
- Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia. Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).
- Hedlund, J. U., Ortqvist, A. B., Kalin, M. E., Granath, F.
Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.
Reimpressões e permissões
