L’Assemblée et la Purification du Prototype spumavirus Intasomes

Summary

Recombinant intégrase rétrovirale et oligomères d’ADN imitant les extrémités de l’ADN virales peuvent former un complexe enzymatiquement actif connu comme un intasome. Intasomes peut être utilisé pour les études cinétiques, structurales et biochimiques. Ce protocole détaille comment assembler et purifier le prototype spumavirus intasomes.

Abstract

A définition de fonctionnalité et une étape essentielle du cycle de vie rétrovirus est l’intégration du génome viral dans le génome hôte. Tous les rétrovirus encodent une enzyme intégrase (IN) qui catalyse la jonction covalente de virus à ADN, qui est connu comme transfert de brin d’hôte. Intégration peut-être être modélisés dans vitro par recombinaison IN rétrovirale et oligomères d’ADN imitant les extrémités du génome viral. Afin de mieux récapituler la réaction d’intégration qui se produit in vivo, intégration complexes sont assemblés de recombinaison IN et oligomères synthétiques par dialyse dans un tampon de la concentration en sel réduit. L’intégration complexe, appelée un intasome, peut être purifiée par chromatographie d’exclusion. Dans le cas des virus spumeux expérimental (PFV), l’intasome est un tétramère de po et deux ADN oligomères et on sépare facilement de IN monomère et oligomères gratuit ADN. L’efficacité de l’intégration du PFV intasomes peut-être être dosée sous une variété de conditions expérimentales afin de mieux comprendre la dynamique et la mécanique d’intégration rétrovirale.

Introduction

Intégration du génome viral dans le génome de l’hôte est une étape obligatoire dans le cycle de vie de tous les rétrovirus¹. L’intégrase enzyme virale (IN) catalyse covalente par le rattachement de chaque extrémité du génome ADN viral à l’hôte de l’ADN. Au cours d’une infection cellulaire, en fait partie d’un complexe d’intégration préalable qui intervient dans l’intégration. Recombinant IN complexé avec double brin oligomères d’ADN imitant les extrémités de l’ADN virales peut effectuer aussi intégration dans une cible ADN in vitro². Une commune intégration dosage in vitro utilise un plasmide surenroulé comme l’ADN cible. Intégration des deux oligomères d’ADN virales (vDNA) pour le plasmide donne un produit linéaire et est appelée intégration concertée (Figure 2 a). L’intégration dosage in vitro peut aussi donnent des produits avec vDNA qu’une seule liaison covalente a rejoint pour le plasmide de cible, ce qui entraîne un cercle détendu. Ce produit demi-site intégration semble être un artefact de l’ essai in vitro.

Recombinant IN et vDNA peuvent effectuer l’intégration in vitro, mais ils ne sont pas réactifs idéales pour l’étude de la dynamique ou la structure des complexes d’intégration lorsque IN monomère obscurciraient visualisation pertinente. Complexes d’intégration purifiée, ou « intasomes », sont nécessaires pour les études structurelles ou analyse dynamique seule molécule. PFV IN et vDNAs peuvent être assemblés par dialyse d’une mémoire tampon de concentration relativement élevée de sel à une plus faible concentration en sel^3,4. Au cours de la dialyse, un précipité formes. Ce précipité est supprimé de la dialyse et la concentration en sel est augmentée. La plus forte concentration de sel solubilise le précipité contenant intasomes PFV. Les intasomes sont ensuite purifiés par chromatographie d’exclusion (s). Recombinant prototype virus spumeux (PFV) IN a démontré d’exister comme monomère en solution, à des concentrations allant jusqu’à 225 µM⁵. Fractionnement SEC sépare efficacement l’intasomes PFV (225,5 kDa), qui comprend un tétramère de PFV IN et deux vDNAs, de monomère PFV dans (44,4 kDa) et gratuit vDNA (24,0 kDa). La PFV intasomes peuvent être congelés et conserver l’activité d’intégration pendant au moins six mois de stockage à-80 ° c.

Recombinant PFV intasomes peut également être modifiée pour inclure dans les substitutions d’acides aminés ou des mutations de troncature ou vDNAs marquées avec des fluorophores ou biotine^4,6. Les intasomes PFV purifiés facilement effectuer une intégration dans une cible de plasmide supercoiled ADN in vitro. Analyses biochimiques intégration en vrac avec intasomes peuvent tester les effets de mutations, inhibiteurs, ou autres additifs chimiques. Intasomes biotinylé peut être utilisé pour sonder les affinités avec les acides nucléiques ou des protéines. PFV intasomes fonctionnent à température ambiante permettant analyse microscopie seule molécule par pince magnétique pour mesurer le temps entre l’assemblage des deux extrémités de la vDNA ou fluorescence de réflexion interne totale de visualiser la recherche intasome sur cible ADN⁶. En outre, intasomes PFV ont été les premiers à être structurellement caractérisent impactant considérablement le domaine de l’intégration rétrovirale³.

Protocol

1. recuit de vDNA Combine 1 X tampon de dix (10 X 10 stock : 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, EDTA de 10 mM), 10 µM Oligo 1 (5′ ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3′, 100 µM stock) et 10 µM Oligo 2 (5′ CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3′, 100 µM stock) dans un volume final de 1,5 mL . Aliquote 25 µL dans soixante tubes de 0,2 mL polymérase chain reaction (PCR).Remarque : Selon l’application, oligomères peuvent être modifiées avec des fluorophores ou des balises à l’extrémité …

Representative Results

PFV intasomes sont assemblés à partir de recombinaison IN et vDNA. Après le montage, les intasomes sont purifiés par SEC (Figure 1). Activité d’intégration de chaque fraction est analysée avec une supercoiled l’ADN cible et agarose électrophorèse sur gel (Figure 2). Ce gel est photographié avec un scanner fluorescent défini pour détecter le bromure d’éthidium (et un fluorophore, si vDNA marqués au fluorophore …

Discussion

INs retroviral forment un complexe avec l’ADN génomique viral pour effectuer une intégration et continuer le cycle de vie viral multimère. Le nombre de monomères par intasome peut être tétramères, octamères ou éventuellement plus élevés ordre multimères^11,12,13,14. PFV intasomes sont un tétramère de recombinaison avec des oligomères d’ADN double brin qui imitent l’ADN géno…

Materials

DNA Oligomers	IDT	N/A	Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters	Sigma-Aldrich	Z677094-24EA	3 kDa MWCO
DTT	P212121	SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
MgSO4	Amresco	0662
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Gel-loading tips, 1 – 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100	Fisher Scientific	12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL	Thermo Fisher Scientific	568-0020
Dialysis tubing clips	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201
Hi-Res Standard Agarose	AGTC Bioproducts	AG500D1
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Orange G	Fisher Scientific	0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes	Denville Scientific	CB4225-4