विधानसभा और प्रोटोटाइप फोम वायरस Intasomes का शुद्धिकरण
Summary
रिकॉमबिनेंट retroviral integrase और डीएनए oligomers नकल उतार वायरल डीएनए समाप्त होता है एक enzymatically सक्रिय एक intasome के रूप में जाना जाता जटिल फार्म कर सकते हैं । Intasomes जैव रासायनिक, संरचनात्मक, और काइनेटिक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इस प्रोटोकॉल का ब्यौरा कैसे इकट्ठा करने के लिए और प्रोटोटाइप फोम वायरस intasomes शुद्ध ।
Abstract
एक परिभाषित सुविधा और retrovirus जीवन चक्र के आवश्यक कदम मेजबान जीनोम में वायरल जीनोम के एकीकरण है । सभी retroviruses सांकेतिक शब्दों में बदलना एक integrase (में) एंजाइम कि वायरल की मेजबानी डीएनए, जो कतरा स्थानांतरण के रूप में जाना जाता है आबंध में शामिल होने catalyzes । एकीकरण में रिकॉमबिनेंट retroviral और डीएनए oligomers वायरल जीनोम के सिरों नकल उतार के साथ इन विट्रो में मॉडलिंग की जा सकती है । आदेश में और अधिक निकटता दोहराऊंगा एकीकरण प्रतिक्रिया है कि vivo मेंहोता है के लिए, एकीकरण परिसरों में रिकॉमबिनेंट से इकट्ठा कर रहे है और सिंथेटिक oligomers में डायलिसिस द्वारा एक कम नमक एकाग्रता बफर । एकीकरण परिसर, एक intasome कहा जाता है, आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी द्वारा शुद्ध किया जा सकता है । प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) के मामले में, intasome में और दो डीएनए oligomers के एक tetramer है और आसानी से monomeric में और मुक्त oligomer डीएनए से अलग है । PFV intasomes के एकीकरण दक्षता बेहतर गतिशीलता और retroviral एकीकरण के यांत्रिकी को समझने के लिए प्रयोगात्मक शर्तों की एक किस्म के तहत परख की जा सकती है ।
Introduction
मेजबान जीनोम में वायरल जीनोम के एकीकरण सभी retroviruses1के जीवन चक्र में एक अनिवार्य कदम है । वायरल एंजाइम integrase (में) catalyzes की मेजबानी डीएनए को वायरल डीएनए जीनोम के प्रत्येक छोर के आबंध में शामिल होने । एक सेलुलर संक्रमण के दौरान, में एक पूर्व एकीकरण जटिल है कि मध्यस्थता एकीकरण का हिस्सा है. रिकॉमबिनेंट में डबल फंसे डीएनए oligomers नकल उतार वायरल डीएनए समाप्त होता है के साथ जटिल भी इन विट्रो2में एक लक्ष्य डीएनए में एकीकरण प्रदर्शन कर सकते हैं । इन विट्रो में एक आम एकीकरण परख लक्ष्य डीएनए के रूप में एक supercoiled प्लाज्मिड का इस्तेमाल करता है । दोनों वायरल डीएनए oligomers के एकीकरण (vDNA) एक रैखिक उत्पाद में प्लाज्मिड परिणामों के लिए और संगठित एकीकरण (चित्रा 2a) का कार्यकाल है । इन विट्रो में एकीकरण परख भी केवल एक vDNA covalently लक्ष्य प्लाज्मिड में शामिल हो गए एक आराम चक्र में जिसके परिणामस्वरूप के साथ उत्पादों उपज सकता है । इस आधे साइट एकीकरण उत्पाद के लिए इन विट्रो मेंपरख की एक मूर्ति प्रतीत होता है ।
रिकॉमबिनेंट और vDNA इन विट्रो मेंएकीकरण कर सकते हैं, लेकिन जब monomeric प्रासंगिक दृश्य में अस्पष्ट होता है, तो वे एकीकरण परिसरों की गतिशीलता या संरचना के अध्ययन के लिए आदर्श रिएजेंट नहीं होते हैं । शुद्ध एकीकरण परिसरों, या “intasomes,” गतिशील एकल अणु विश्लेषण या संरचनात्मक अध्ययन के लिए आवश्यक हैं । PFV और vDNAs में एक अपेक्षाकृत उच्च नमक एकाग्रता बफर से डायलिसिस द्वारा इकट्ठा किया जा सकता है एक कम नमक एकाग्रता3,4। डायलिसिस के दौरान, एक हाला रूपों । इस हाला को डायलिसिस से निकाला जाता है और नमक की एकाग्रता बढ़ाई जाती है । उच्च लवण एकाग्रता solubilizes PFV intasomes युक्त हाला । intasomes तो आकार अपवर्जन क्रोमैटोग्राफी (एसईसी) द्वारा शुद्ध कर रहे हैं । रिकॉमबिनेंट प्रोटोटाइप फोम वायरस (PFV) में है को सांद्रता पर समाधान में एक मोनोमर के रूप में मौजूद 225 µ m5को दिखाया गया है । एसईसी आंशिक प्रभावी रूप से अलग PFV intasomes (२२५.५ केडीए), जिसमें PFV के एक tetramer और दो vDNAs में, monomeric PFV से (४४.४ केडीए) और मुक्त vDNA (२४.० केडीए) शामिल हैं । PFV intasomes जमे हुए हो सकता है और भंडारण के ंयूनतम छह महीने के लिए एकीकरण गतिविधि बनाए रखने में-80 ˚ सी ।
रिकॉमबिनेंट PFV intasomes भी अमीनो एसिड प्रतिस्थापन या जनचेतना उत्परिवर्तनों या fluorophores या बायोटिन4,6के साथ लेबल vDNAs में शामिल करने के लिए संशोधित किया जा सकता है । शुद्ध PFV intasomes आसानी से इन विट्रो मेंएक supercoiled प्लाज्मिड लक्ष्य डीएनए में एकीकरण प्रदर्शन करते हैं । intasomes के साथ थोक जैव रासायनिक एकीकरण परख उत्परिवर्तनों में, अवरोधकों, या अंय रासायनिक additives में के प्रभाव का परीक्षण कर सकते हैं । Biotinylated intasomes न्यूक्लिक एसिड या प्रोटीन के साथ संबंध जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । PFV intasomes चुंबकीय चिमटी द्वारा एकल अणु माइक्रोस्कोपी विश्लेषण के लिए दो vDNA समाप्त होता है या कुल आंतरिक प्रतिबिंब के शामिल होने के बीच समय को मापने के लिए अनुमति परिवेश के तापमान पर कार्यात्मक है प्रतिदीप्ति लक्ष्य पर खोज intasome कल्पना करने के लिए DNA6. इसके अलावा, PFV intasomes पहले से संरचनात्मक रूप से काफी retroviral एकीकरण3के क्षेत्र को प्रभावित विशेषता हो रहे थे ।
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroviral INs वायरल जीनोमिक डीएनए के साथ एक multimeric परिसर के रूप में एकीकरण प्रदर्शन और वायरल जीवन चक्र जारी है । मोनोमर प्रति intasome में की संख्या tetramers, octamers, या संभवत: उच्च क्रम multimers11,12,13…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस काम NIH AI099854 और AI126742 कुंजी को समर्थन किया गया था ।
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referências
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