Montering og rensing av Prototype skummende Virus Intasomes
Summary
Rekombinant retroviral integrase og DNA oligomers etterligne viral DNA ender kan danne en enzymatisk aktive komplekset kalles en intasome. Intasomes kan brukes for biokjemiske, strukturelle og kinetisk studier. Denne protokollen detaljer kursen og rense prototype skummende virus intasomes.
Abstract
A definere funksjonen og nødvendig trinn i livssyklusen til retrovirus er integrering av viral genomet til verten genomet. Alle retroviruses kode et integrase (IN) enzym som gir kovalente sammenføyning av viral vert DNA, som er kjent som strand overføring. Integrering kan være modellert i vitro med rekombinant retroviral IN og DNA oligomers etterligne endene av viral genomet. For å nærmere recapitulate integrering reaksjonen som oppstår i vivo, integrering komplekser er satt sammen av rekombinant i og syntetisk oligomers av dialyse i en redusert saltkonsentrasjon buffer. Integrering komplekse, kalt en intasome, kan bli renset ved størrelse utelukkelse kromatografi. I prototype skummende virus (PFV), intasome er en tetramer av IN og to DNA oligomers og skilles lett fra monomerisk i og gratis oligomer DNA. Integrering effektiviteten av PFV intasomes kan være assayed under en rekke eksperimentelle forhold å bedre forstå dynamikken og mekanikken i retroviral integrering.
Introduction
Integrering av viral genomet til verten genomet er et obligatorisk trinn i livssyklusen til alle retroviruses1. Viral enzymet integrase (IN) gir kovalente sammenføyning av hver ende av viral DNA genomet til verten DNA. Under en mobilnettet infeksjon, er en del av en pre integrering kompleks som formidler integrering. Rekombinant i kompleksbundet med dobbel strandet DNA oligomers etterligne viral DNA endene kan også utføre integrering i målet DNA i vitro2. En felles integrering analysen i vitro benytter en supercoiled plasmider målet DNA. Integrasjon av både viral DNA oligomers (vDNA) til plasmider en lineær produktet og kalles felles integrering (figur 2A). Den integrering analysen i vitro kan også gi produkter med bare én vDNA covalently koblet til målet plasmider resulterer i en avslappet sirkel. Halv-site integrering produktet synes å være en gjenstand på analysen i vitro.
Rekombinant i og vDNA kan utføre integrering i vitro, men de er ikke ideelt reagensene studiet av dynamikken eller struktur av integrasjon komplekser når monomerisk IN ville skjule relevante visualisering. Renset integrering komplekser, eller “intasomes,” kreves for dynamisk ett molekyl analyse eller strukturelle studier. PFV i og vDNAs kan settes sammen av dialyse fra en relativt høy saltkonsentrasjon buffer til en lavere saltkonsentrasjon3,4. Under dialyse, en utløse skjemaer. Dette utløse fjernes fra dialyse og salt konsentrasjonen er økt. Den høyere saltkonsentrasjon solubilizes bunnfall inneholder PFV intasomes. Intasomes er så renset ved størrelse utelukkelse kromatografi (SEC). Rekombinant prototype skummende virus (PFV) IN har vist å eksistere som en monomer i løsning på konsentrasjoner opptil 225 µM5. SEC fraksjoneres skiller effektivt PFV intasomes (225.5 kDa), som inkluderer en tetramer av PFV i og to vDNAs, monomerisk PFV i (44.4 kDa) og gratis vDNA (24.0 kDa). PFV intasomes kan fryses og beholde integrering aktivitet i minst seks måneder av bagasje på-80 grader.
Rekombinant PFV intasomes kan også endres for å inkludere i aminosyre erstatninger eller trunkering mutasjoner eller vDNAs merket med fluorophores eller biotin4,6. De renset PFV intasomes utføre lett integrering i et supercoiled plasmider mål DNA i vitro. Bulk biokjemiske integrering analyser med intasomes kan teste effekten av i mutasjoner, hemmere eller andre kjemiske tilsetningsstoffer. Biotinylated intasomes kan brukes å undersøke slektskap med nukleinsyrer eller proteiner. PFV intasomes er funksjonelle ved omgivelsestemperatur muliggjør enkel molekyl mikroskopi analyse av magnetiske pinsetter å måle tiden mellom sammenføyning av to vDNA endene eller totale interne refleksjon fluorescens å visualisere intasome søk på målet DNA6. I tillegg var PFV intasomes først til å være strukturelt preget betydelig påvirker feltet retroviral integrering3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retroviral moduler danner en multimeric kompleks med viral genomisk DNA å utføre integrering og fortsette viral livssyklusen. Antall i monomerer per intasome kan være tetramers, octamers eller muligens høyere orden multimers11,12,13,14. PFV intasomes er en tetramer av rekombinant med double-strandet DNA oligomers som etterligner viral genomisk DNA ender3. Di…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av NIH AI099854 og AI126742 til nøkkelen.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referências
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
