Ассамблея и очистки прототип пенистый вирус Intasomes
Summary
Рекомбинантных ретровирусной интеграза и ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы могут образовывать ферментативно активный комплекс, известный как intasome. Intasomes может использоваться для исследования биохимических, структурных и кинетические. Этот протокол описывает собрать и очистить прототип пенистый вирус intasomes.
Abstract
A определение функции и необходимый шаг жизненного цикла ретровируса является интеграция вирусного генома в геноме принимающей. Все ретровирусы кодировать фермент интеграза (IN), который катализирует ковалентных присоединения вирусных хост ДНК, который известен как стренги передачи. Интеграция может быть моделируется в пробирке с рекомбинантным антиретровирусного лечения в и ДНК олигомеров, подражая концы вирусного генома. Для того, чтобы более тесно пилки интеграции реакции, которая происходит в естественных условиях, интеграции комплексы собираются из рекомбинантных IN и синтетические олигомеров методом диализа в буфере снижение концентрации соли. Интеграции комплекса, называется intasome, может очистить хромотографией размер исключения. В случае прототип пенистый вирус (PFV) intasome Тетрамер IN и два ДНК олигомеров и легко отделяется от мономерных IN и бесплатные олигомера ДНК. Эффективность интеграции PFV intasomes может assayed под целый ряд экспериментальных условиях, чтобы лучше понять динамику и механики ретровирусной интеграции.
Introduction
Интеграция вирусного генома в геноме хост это обязательный шаг в жизненном цикле все ретровирусы1. Вирусный фермент интеграза (IN) катализирует ковалентных присоединения каждого конца вирусной ДНК генома к хосту ДНК. Во время сотовой инфекции в является частью комплекса до интеграции, которая опосредует интеграции. В рекомбинантной complexed с двойной мель ДНК олигомеров, подражая вирусной ДНК концы можно также выполнить интеграцию целевых ДНК в пробирке2. Общей интеграции пробирного в vitro использует supercoiled плазмиды ДНАО цели. Интеграция обеих вирусной ДНК олигомеров (vDNA) для плазмида приводит в линейный продукт и называется согласованной интеграции (рисунок 2A). Интеграции пробирного в пробирке может также принести продуктов с ковалентно присоединены к целевой плазмида, что приводит к расслабленной круг только один vDNA. Этот продукт интеграции половину сайт, как представляется, артефакт пробирного в пробирке.
В рекомбинантной и vDNA могут выполнять интеграцию в пробирке, но они не являются идеальным реагенты для изучения динамики или структуры интеграции комплексов, когда мономерных в будет затушевывать соответствующие визуализации. Очищенный интеграции комплексов, или «intasomes,» необходимы для анализа или структурные исследования динамических одной молекулы. PFV IN и vDNAs могут собираться методом диализа с относительно высокой концентрации соли буфера меньше концентрация соли3,4. Во время диализа, преципитат формы. Этот осадок удаляется из диализа и увеличение концентрации соли. Более высокие концентрации соли solubilizes осадок содержащий PFV intasomes. Intasomes затем очищенная методом размер гель-проникающей хроматографии (SEC). Было показано, что рекомбинантных прототип пенистый вирус (PFV) в существование в качестве мономера в растворе в концентрациях до 225 мкм5. SEC фракционирование эффективно отделяет PFV intasomes (225.5 кДа), который включает в себя Тетрамер PFV в и два vDNAs, от мономерных PFV в (44,4 кДа) и бесплатные vDNA (24.0 кДа). PFV intasomes могут быть заморожены и удерживать интеграции деятельности по крайней мере шесть месяцев хранения на-80 градусов.
Рекомбинантных PFV intasomes также могут быть изменены для включения в аминокислотных замен или усечение мутации или vDNAs помечены флуорофоров или биотин4,6. Очищенный intasomes PFV легко выполнить интеграцию в мишень supercoiled плазмида ДНК в пробирке. Массовых анализов биохимической интеграции с intasomes может проверить последствия в мутации, ингибиторы, или других химических добавок. Биотинилированным intasomes может использоваться для датчика близости с нуклеиновых кислот и белков. PFV intasomes функционируют при температуре окружающей среды, позволяя одной молекулы микроскопии анализа Магнитные пинцеты для измерения времени между присоединения двух концах vDNA или полное внутреннее отражение флуоресценции для визуализации intasome Поиск цели ДНК6. Кроме того PFV intasomes были первым быть структурно характеризуется значительно влияющих области антиретровирусного лечения интеграции3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Антиретровирусные модулей образуют multimeric комплекс с вирусной геномной ДНК для выполнения интеграции и продолжить вирусный жизненного цикла. Количество в мономеров в intasome может быть тетрамера, octamers или возможно выше порядок мультимеры11,12,,<sup…
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана низ AI099854 и AI126742 к ключу.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referências
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
