Asamblea y purificación del prototipo Virus espumoso de los Intasomes

Summary

Integrasa de retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico extremos de DNA virales pueden formar un complejo enzimático activo conocido como un intasome. Intasomes puede ser usada para estudios bioquímicos, estructurales y cinéticos. Este protocolo detalla cómo montar y purificar el prototipo virus espumoso de los intasomes.

Abstract

A definición de función y paso necesario del ciclo de vida de retrovirus es la integración del genoma viral en el genoma del anfitrión. Los retrovirus codifican enzima integrasa (IN) que cataliza la unión covalente de viral a anfitrión DNA, que se conoce como transferencia de cadena. Integración puede ser modelada en vitro con IN retrovirus recombinante y oligómeros de ADN mímico los extremos del genoma viral. Con el fin de recapitular más de cerca la reacción de integración que se presenta en vivo, integración complejos son ensamblados de oligómeros sintéticos y recombinante IN por diálisis en un tampón de menor concentración de sal. La integración compleja, llamada un intasome, puede ser purificada por cromatografía por exclusión de tamaño. En el caso de virus espumoso de los prototipos (PFV), el intasome es un tetrámero de IN y oligómeros de ADN dos y se separa fácilmente en monomérica y oligómero gratuito ADN. La eficacia de la integración de intasomes PFV puede ensayarse bajo una variedad de condiciones experimentales para comprender mejor la dinámica y la mecánica de integración retroviral.

Introduction

Integración del genoma viral en el genoma del anfitrión es un paso obligatorio en el ciclo de vida de todos los retrovirus¹. La enzima viral integrasa (IN) cataliza la unión covalente de los extremos del genoma viral de la DNA al anfitrión DNA. Durante una infección celular, en forma parte de un complejo de pre-integración que media integración. Recombinante en complexed con oligómeros de ADN de doble trenzados mímico los extremos del ADN virales también puede realizar la integración en un ADN en vitrode objetivo². Un común integración análisis en vitro utiliza un plásmido superenrollado como el ADN diana. Integración de ambos oligómeros de ADN virales (vDNA) para el plásmido da lugar a un producto lineal y se denomina integración concertada (figura 2A). La integración análisis de vitro también se pueden producir productos con sólo un vDNA covalentemente unido al plásmido de blanco dando como resultado un círculo relajado. Este producto de la integración de medio sitio parece ser un artefacto del ensayo in vitro.

Recombinante en y vDNA pueden realizar integración en vitro, pero no son reactivos ideal para el estudio de la dinámica o estructura de los complejos de integración cuando IN monomérica oscurecería visualización pertinente. Complejos de integración purificado, o “intasomes,” son necesarios para estudios de análisis o estructural dinámico a la sola molécula. EN PFV y vDNAs puede ser montada por diálisis de un búfer relativamente alta concentración de sal a una baja concentración de sal^3,4. Durante la diálisis, un precipitado formas. Este precipitado se elimina de la diálisis y se aumenta la concentración de sal. La mayor concentración de sal solubiliza el precipitado que contiene intasomes PFV. El intasomes entonces se purifican por cromatografía por exclusión de tamaño (SEC). Prototipo recombinante virus espumoso (PFV) IN se ha demostrado que existe como monómero en solución a concentraciones de hasta 225 μm⁵. Fraccionamiento s efectivamente separa la intasomes PFV (225,5 kDa), que incluye un tetrámero en PFV y dos vDNAs, PFV monomérica en (44,4 kDa) y vDNA gratis (24.0 kDa). La intasomes PFV pueden congelar y conservar actividad de integración para al menos seis meses de almacenamiento a-80 ° c.

Recombinante intasomes PFV también puede ser modificada para incluir en las substituciones del aminoácido o mutaciones de truncamiento o vDNAs con fluoróforos o biotina^4,6. Las intasomes PFV purificados fácilmente realizar integración en un objetivo de plásmido superenrollado ADN en vitro. Ensayos de integración bioquímica a granel con intasomes pueden probar los efectos de en mutaciones, inhibidores, o otros aditivos químicos. Biotinilado intasomes puede utilizarse para sonda afinidad con proteínas o ácidos nucleicos. Intasomes PFV funcionan a temperatura ambiente permitiendo análisis de microscopia sola molécula por pinza magnética para medir el tiempo entre la Unión de los dos extremos de vDNA o fluorescencia de la reflexión interna total para visualizar la búsqueda intasome en blanco De ADN⁶. Además, PFV intasomes fueron los primeros en ser estructuralmente caracterizan impactando significativamente el campo de la integración retroviral³.

Protocol

1. recocido de vDNA Combinar 1 X Buffer 10 (10 X 10 stock: 100 mM Tris-HCl, pH 8,0, 1 M NaCl, 10 mM EDTA), 10 μm 1 Oligo (5′ ATTGTCATGGAATTTTGTATATTGAGTGGCGCCCGAACAG 3′, 100 acciones μm) y 10 μm 2 Oligo (5′ CTGTTCGGGCGCCACTCAATATACAAAATTCCATGACA 3′, 100 acciones μm) en un volumen final de 1.5 mL . Alícuota de 25 μL en tubos de reacción en cadena (PCR) de 0.2 mL polimerasa sesenta.Nota: Dependiendo de la aplicación, oligómeros pueden modificarse con fluoróforos o etiquetas en el extremo 5′-2 Oligo …

Representative Results

Intasomes PFV son ensamblados de IN recombinante y vDNA. Después del montaje, intasomes son purificadas por segundos (figura 1). Actividad de integración de cada fracción se ensayaron con un superenrollado ADN blanco y agarosa electroforesis en gel (figura 2). Este gel es reflejado con un analizador fluorescente para detectar EtBr (y fluoróforo, si se utiliza el fluoróforo vDNA). Usando software de análisis de imagen, volú…

Discussion

Retroviral INs forman un complejo con DNA genómica viral para realizar integración y continuar el ciclo de vida viral multimérica. El número de monómeros por intasome puede ser tetrámeros, octamers o posiblemente mayor orden Multímeros^11,12,13,14. Intasomes PFV son un tetrámero de recombinante con oligómeros de ADN bicatenario que imitan la DNA genomic viral termina^3<…

Materials

DNA Oligomers	IDT	N/A	Custom DNA Oligos
Tris Ultra Pure	Gojira Fine Chemicals	UTS1003
NaCl	P212121	RP-S23020
UltraPure EDTA	Invitrogen/Gibco	15575
Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters	Sigma-Aldrich	Z677094-24EA	3 kDa MWCO
DTT	P212121	SV-DTT
BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration)	Sigma-Aldrich	B6755-500G
ZnCl2	Sigma-Aldrich	208086
MgSO4	Amresco	0662
Glycerol	Thermo Fisher Scientific	G37-20
Gel-loading tips, 1 – 200 μL	Corning	CLS4853-400EA
Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100	Fisher Scientific	12-640
Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL	Thermo Fisher Scientific	568-0020
Dialysis tubing clips	Spectrum Labs	132734
6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing	Spectrum Medical	132645
Superose 6 10/300 GL	GE Healthcare Life Sciences	17517201
Hi-Res Standard Agarose	AGTC Bioproducts	AG500D1
Ethidium bromide	Thermo Fisher Scientific	BP1302
Orange G	Fisher Scientific	0-267
Hyladder 10kb, 500 lanes	Denville Scientific	CB4225-4