Montering och rening av prototyp skummande Virus Intasomes
Summary
Rekombinant retrovirala integras och DNA oligomerer härma virala DNA-ändarna kan bilda ett enzymatiskt aktivt komplex som kallas en intasome. Intasomes kan användas för biokemiska, strukturella och kinetiska studier. Detta protokoll Detaljer hur man monterar och rena prototyp skummande virus intasomes.
Abstract
A definiera funktionen och nödvändigt steg av retrovirus livscykel är integrationen av det virala genomet i värd genomet. Alla retrovirus koda en integrashämmare (IN) enzym som katalyserar den kovalenta sammanfogningen av viral till värd DNA, som kallas strand överföring. Integration kan vara modellerade i vitro med rekombinant retrovirala IN och DNA oligomerer härma ändarna av det virala genomet. För att sammanfatta närmare integration reaktionen som uppstår i vivo, integration är komplex monteras från rekombinant IN och syntetiska oligomerer av dialys i en minskad salthalt buffert. Att integrera komplexa, kallas en intasome, kan renas genom storlek utslagning kromatografi. När det gäller prototyp skummande virus (PFV), intasome är en tetramer av i och två DNA oligomerer och separeras lätt från monomer IN och gratis oligomer DNA. PFV intasomes integration effektivitet kan analyseras under en mängd experimentella förhållanden att bättre förstå dynamiken och mekanik av retrovirala integration.
Introduction
Integrering av det virala genomet i värd genomet är ett obligatoriskt steg i livscykeln för alla retrovirus1. Den virala enzymet integras (IN) katalyserar den kovalenta sammanfogningen av varje ände av det virala DNA-genomet till värd DNA. Under en cellulär infektion, är en del av ett före integration-komplex som medierar integration. Rekombinant i komplex med dubbel stranded DNA oligomerer härma de virala DNA-ändarna kan också utföra integrering i en target DNA in vitro-2. En gemensam integration test in vitro- använder en supercoiled plasmid som mål DNA. Integrering av både viral DNA oligomerer (vDNA) till plasmiden resulterar i en linjär produkt och kallas samordnade integration (figur 2A). Den integration test in vitro- kan också ge produkter med endast en vDNA kovalent ansluten till målet plasmiden vilket resulterar i en avslappnad cirkel. Denna halv-site integrering produkt verkar vara en artefakt av test in vitro.
Rekombinant IN och vDNA kan utföra integration i vitro, men de är inte perfekta reagenser för studiet av dynamiken eller struktur av integration komplex när monomer IN skulle skymma relevanta visualisering. Renat integration komplex, eller ”intasomes”, krävs för dynamiska enda molekyl analys eller strukturella studier. PFV IN och vDNAs kan monteras genom dialys från en relativt hög saltkoncentration buffert till en lägre saltkoncentration3,4. Under dialys, en fällning former. Denna utfällning tas bort från dialys och Saltkoncentrationen ökar. Högre Saltkoncentrationen solubilizes den fällning som innehåller PFV intasomes. Intasomes sedan renas genom storlek utslagning kromatografi (SEC). Rekombinant prototyp skummande virus (PFV) IN har visat att existera som en monomer i lösningen vid koncentrationer upp till 225 µM5. SEC fraktionering separerar effektivt det PFV intasomes (225.5 kDa), som omfattar en tetramer PFV i och två vDNAs, från monomer PFV i (44,4 kDa) och gratis vDNA (24,0 kDa). Den PFV intasomes kan frysas och bevara integration aktivitet för minst sex månaders lagring vid-80 ˚C.
Rekombinant PFV intasomes kan också ändras för att inkludera i aminosyran substitutioner eller trunkering mutationer eller vDNAs märkt med fluorophores eller biotin4,6. De renade PFV intasomes utför lätt integreras måltavla supercoiled plasmid DNA i vitro. Bulk biokemiska integration analyser med intasomes kan testa effekterna av mutationer, i-hämmare eller andra kemiska tillsatser. Biotinylerade intasomes kan användas till probe samhörighet med nukleinsyror eller proteiner. PFV intasomes är funktionella vid omgivande temperatur möjliggör enda molekyl mikroskopi analys av magnetisk pincett att mäta tiden mellan sammanfogningen av de två vDNA ändar eller totalreflexion fluorescens att visualisera intasome Sök på målet DNA6. PFV intasomes var dessutom först med att vara strukturellt kännetecknas avsevärt påverkar området för retrovirala integration3.
Protocol
Representative Results
Discussion
Retrovirala INs bildar ett multimeric komplex med viral genomiskt DNA att utföra integrering och fortsätta viral livscykel. Antalet i monomerer per intasome kan vara tetramers, octamers eller eventuellt högre ordning multimers11,12,13,14. PFV intasomes är en tetramer av rekombinant in med dubbelsträngat DNA oligomerer som efterliknar viral genomiskt DNA slutar3….
Declarações
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöds av NIH AI099854 och AI126742 till nyckel.
Materials
| DNA Oligomers | IDT | N/A | Custom DNA Oligos |
| Tris Ultra Pure | Gojira Fine Chemicals | UTS1003 | |
| NaCl | P212121 | RP-S23020 | |
| UltraPure EDTA | Invitrogen/Gibco | 15575 | |
| Amicon Ultra 0.5 mL centrifugal filters | Sigma-Aldrich | Z677094-24EA | 3 kDa MWCO |
| DTT | P212121 | SV-DTT | |
| BIS-TRIS propane,>=99.0% (titration) | Sigma-Aldrich | B6755-500G | |
| ZnCl2 | Sigma-Aldrich | 208086 | |
| MgSO4 | Amresco | 0662 | |
| Glycerol | Thermo Fisher Scientific | G37-20 | |
| Gel-loading tips, 1 – 200 μL | Corning | CLS4853-400EA | |
| Razor blade; Single-edged; 100/Pk.; Pack of 100 | Fisher Scientific | 12-640 | |
| Sterile Disposable Filter Units with PES Membrane > 250mL | Thermo Fisher Scientific | 568-0020 | |
| Dialysis tubing clips | Spectrum Labs | 132734 | |
| 6-8 kDa 10 mm Dialysis Tubing | Spectrum Medical | 132645 | |
| Superose 6 10/300 GL | GE Healthcare Life Sciences | 17517201 | |
| Hi-Res Standard Agarose | AGTC Bioproducts | AG500D1 | |
| Ethidium bromide | Thermo Fisher Scientific | BP1302 | |
| Orange G | Fisher Scientific | 0-267 | |
| Hyladder 10kb, 500 lanes | Denville Scientific | CB4225-4 |
Referências
- Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. . Retroviruses. , (1997).
- Valkov, E., et al. Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus. Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).
- Hare, S., Gupta, S. S., Valkov, E., Engelman, A., Cherepanov, P. Retroviral intasome assembly and inhibition of DNA strand transfer. Nature. 464 (7286), 232-236 (2010).
- Li, M., Lin, S., Craigie, R. Outer domains of integrase within retroviral intasomes are dispensible for catalysis of DNA integration. Protein Sci. 25 (2), 472-478 (2016).
- Gupta, K., et al. Solution conformations of prototype foamy virus integrase and its stable synaptic complex with U5 viral DNA. Structure. 20 (11), 1918-1928 (2012).
- Jones, N. D., et al. Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration. Nat Commun. 7, 11409 (2016).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Altman, M. P., Yoder, K. E. Detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Vis Exp. , (2017).
- Lopez, M. A., Mackler, R. M., Yoder, K. E. Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase. J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).
- Poirier, M. G., Bussiek, M., Langowski, J., Widom, J. Spontaneous access to DNA target sites in folded chromatin fibers. J Mol Biol. 379 (4), 772-786 (2008).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. J Vis Exp. (62), (2012).
- Ballandras-Colas, A., et al. Cryo-EM reveals a novel octameric integrase structure for betaretroviral intasome function. Nature. 530 (7590), 358-361 (2016).
- Ballandras-Colas, A., et al. A supramolecular assembly mediates lentiviral DNA integration. Science. 355 (6320), 93-95 (2017).
- Passos, D. O., et al. Cryo-EM structures and atomic model of the HIV-1 strand transfer complex intasome. Science. 355 (6320), 89-92 (2017).
- Yin, Z., et al. Crystal structure of the Rous sarcoma virus intasome. Nature. 530 (7590), 362-366 (2016).
- Maertens, G. N., Hare, S., Cherepanov, P. The mechanism of retroviral integration from X-ray structures of its key intermediates. Nature. 468 (7321), 326-329 (2010).
- Maskell, D. P., et al. Structural basis for retroviral integration into nucleosomes. Nature. 523 (7560), 366-369 (2015).
