क्रोमेटिन लूप जीन विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाता है; हालांकि, वहां कोई तकनीकी प्रगति कि क्रोमेटिन छोरों के चयनात्मक और प्रतिवर्ती संशोधन के लिए अनुमति दी गई है । यहाँ हम क्रोमेटिन पाश पुनः के लिए एक शक्तिशाली प्रणाली का वर्णन संगठन CRISPR का उपयोग-dCas9 (CLOuD9), चुनिंदा और reversibly लक्षित loci पर जीन अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए प्रदर्शन किया.
हाल के अध्ययनों से स्पष्ट रूप से पता चला है कि लंबी दूरी की, तीन आयामी क्रोमेटिन पाश बातचीत जीन अभिव्यक्ति के विनियमन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं, लेकिन क्या looping के लिए जिंमेदार है या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का परिणाम अभी भी है अज्ञात. हाल ही में जब तक, कैसे क्रोमेटिन looping जीन गतिविधि और सेलुलर समारोह के विनियमन को प्रभावित करता है अपेक्षाकृत अस्पष्ट है, और इन संरचनाओं में हेरफेर करने के लिए मौजूदा तरीकों में सीमाओं इन बातचीत की गहराई से अंवेषण में रोका । इस अनिश्चितता को हल करने के लिए, हम चुनिंदा और प्रतिवर्ती क्रोमेटिन पाश पुनः संगठन CRISPR-dCas9 (CLOuD9) का उपयोग करने के लिए एक विधि इंजीनियर । CLOuD9 प्रणाली के गतिशीलता को CLOuD9 construction के सफल स्थानीयकरण द्वारा प्रदर्शन किया गया है जीनोमिक loci को लक्षित स्थानीय क्रोमेटिन अनुरूपता । महत्वपूर्ण बात, प्रेरित संपर्क रिवर्स और अंतर्जात क्रोमेटिन अनुरूप बहाल करने की क्षमता भी पुष्टि की गई है । इस पद्धति के साथ जीन अभिव्यक्ति का मॉडुलन सेलुलर जीन अभिव्यक्ति को विनियमित करने की क्षमता स्थापित करता है और स्थिर de नोवो क्रोमेटिन छोरों कि स्पष्ट रूप से जीन को प्रभावित बनाने में इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोगों के लिए महान क्षमता को रेखांकित करता है कैंसर और विकास के संदर्भों में अभिव्यक्ति.
नाभिक में क्रोमेटिन तह और जीनोम के विशिष्ट संगठन के बीच संबंध हाल के वर्षों में महत्वपूर्ण ब्याज की हुई है, क्योंकि यह बारीकी से जीन1,2अभिव्यक्ति के साथ जुड़े होना दिखाया गया है । जबकि जीन गतिविधि और क्रोमेटिन संरचना के मॉडुलन के बीच सटीक संबंध स्पष्ट नहीं रहता है, यह कल्पना की गई है कि गतिशील तीन आयामी क्रोमेटिन संगठन के एक परिणाम के रूप में गुणसूत्र संपर्कों के बीच बातचीत एक सेवा जीन विनियामक समारोह3. दरअसल, इस तरह के एक प्रभाव है अच्छी तरह से मानव ग्लोबिन जीन लोकस, जहां लोकस नियंत्रण क्षेत्र (LCR) में प्रदर्शन किया गया है एक विकास विशेष तरीके से दो क्षेत्रों के बीच एक ग्लोबिन पाश बनाने के द्वारा क्रोमेटिन जीन की गतिविधि को नियंत्रित4। हालांकि, दोनों इस और अंय क्षेत्रों में, यह स्पष्ट नहीं है कि क्या क्रोमेटिन looping एक कारण है या जीन अभिव्यक्ति में परिवर्तन का परिणाम है ।
अब तक, इस घटना का अध्ययन करने में चुनौतियां अनसुलझी रह गई । उदाहरण के लिए, क्रोमेटिन उत्प्रेरण में अंय प्रयास रैखिक डीएनए अनुक्रम या जटिल विशिष्ट तत्वों पर पृष्ठभूमि ज्ञान के एक बहुतायत की आवश्यकता होती है प्रक्रियाओं को संशोधित करने में शामिल छोरों5,6, 7,8. साथ ही, जबकि पिछले काम का सुझाव दिया है कि क्रोमेटिन छोरों एक विशिष्ट और प्रतिबंधित संदर्भ7,8में जीन अभिव्यक्ति ड्राइव, स्तर जिस पर क्रोमेटिन looping को प्रभावित करता है प्रतिलेखन दुनिया भर में अनिश्चित है. हालांकि जीन की अभिव्यक्ति पर लंबी दूरी के छोरों के प्रभाव में रुचि हाल के वर्षों में लगातार हो गया है, की स्थापना और क्रोमेटिन संपर्कों को बनाए रखने के बारे में अनुत्तरित सवाल जीन गतिविधि को बदलने के लिए जारी रहती है ।
तकनीक है कि हम इंजीनियर है nuclease कमी संकुल नियमित रूप से अंतराल लघु palindromic दोहराता है (CRISPR)-CRISPR-एसोसिएटेड प्रोटीन 9 (dCas9), के लिए अनुमति देने के लिए व्यापक रूप से लागू किसी भी जीनोमिक loci9के लक्ष्यीकरण । इस प्रौद्योगिकी जटिल रैखिक डीएनए अनुक्रम के संशोधनों से संबंधित मुद्दों को समाप्त और विशेष looping घटकों के महत्वपूर्ण पूर्व ज्ञान के बिना सुलभ है । सबसे विशेष रूप से, उपकरण सार्वभौमिक और मोटे तौर पर क्रोमेटिन के विकास में मांयता प्राप्त छोरों के रूप में के रूप में अच्छी तरह से कैंसर के रूप में रोगों की एक किस्म में लागू है । CLOuD9 की शक्ति को प्रभावी ढंग से जीन अभिव्यक्ति का नियमन करने के लिए छोरों की संरचना फेरबदल reversibly द्वारा प्रदर्शन किया है.
CLOuD9 क्रोमेटिन लूप्स में सबसे महत्वपूर्ण कदम हैं: 1) डिजाइनिंग या सही gRNAs का उपयोग कर, 2) CLOuD9-transduced कोशिकाओं पर प्रतिदिन बदलते मीडिया, आबा या DMSO सहित, 3) आबा की ताजगी बनाए रखने, और 4) के सटीक और सावधान आकलन प्रदर्शन क्रोमेटिन क्षेऽ ।
CLOuD9 की सीमा मुख्य रूप से पसंद के लक्ष्य क्षेत्र के लिए गाइड डिजाइन करने की क्षमता में रहते हैं । गाइड RNAs डीएनए क्षेत्रों को लक्षित करने के लिए dCas9 घटकों का स्थानीयकरण करने के महत्वपूर्ण कार्य निष्पादित dimerized और गाइड की प्रभावकारिता उनके विशिष्ट लक्ष्य साइट पर आधारित हैं । उचित gRNA घटकों के बिना, CLOuD9 प्रणाली reversibly प्रेरित छोरों फार्म करने में सक्षम नहीं होगा. इस प्रकार, ब्याज के प्रत्येक क्षेत्र के लिए कई गाइड डिजाइन और 250-1000 बीपी के एक क्षेत्र पर गाइडों के प्रसार के द्वारा, कम से एक सफल गाइड सुनिश्चित किया जाएगा । गाइड स्थान भी सटीक परिणाम का अभिंन अंग है । यह प्रतिलेखन कारक बंधन साइटों या अंय महत्वपूर्ण क्षेत्रों में स्थित गाइड से बचने के लिए इस तरह के ऊपर या नीचे प्रतिलेखन के विनियमन के रूप में पृष्ठभूमि प्रभाव को रोकने के लिए महत्वपूर्ण है । इसके अतिरिक्त, CLOuD9 के सटीक स्थान का निर्माण थोड़ा लक्ष्य जीन की प्रतिलिपि प्रभाव कर सकते हैं । यह प्रयोगात्मक प्रयोजनों के लिए सबसे मजबूत जोड़ी की पहचान करने के लिए, प्रत्येक लक्ष्य क्षेत्र के लिए गाइड के कई जोड़े परीक्षण के महत्व पर जोर देती है । इसके अलावा, लक्ष्य क्षेत्रों के प्रत्येक जोड़ी में, CSA निर्माण gRNAs के साथ एस aureusके लिए लक्षित किया जाना चाहिए, और CSP निर्माण विशिष्टता लक्ष्यीकरण के लिए एस pyogenes के लिए gRNAs के साथ निशाना बनाया जाना चाहिए ।
सटीक परिणाम और सही dimerization सुनिश्चित करने के लिए, यह भी CLOuD9 constructs के transduction के बाद सेलुलर वातावरण की ताजगी बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है । दैनिक मीडिया परिवर्तन और ताजा dimerizer (या नियंत्रण) के अलावा यह सुनिश्चित करता है कि पूरक निर्माण निकटता में रहेगा और बदल क्रोमेटिन अनुरूपता बनाए रखेंगे । इसके अलावा, आबा की गारंटी ताजा है और उचित रूप से निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार संग्रहीत किया गया है (6 महीने के भीतर खोला, ठंडा रखा, प्रकाश से सुरक्षित) प्रामाणिक परिणाम प्राप्त करने के लिए आवश्यक है ।
विशेष रूप से, CLOuD9 के लिए आबा dimerizer अबी और PYL dimerization प्रोटीन के साथ प्रयोग किया जाता था, बल्कि अधिक सामांयतः उपयोग FRB और FKBP प्रणाली से । FRB/FKBP प्रणाली के लिए एक rapalog की आवश्यकता CLOuD9 की प्रयोज्यता, कैंसर की कोशिकाओं को विषाक्तता के कारण सीमित होगा । वैकल्पिक अबी/PYL प्रणाली इस सीमा को दरकिनार, प्रभावी ढंग से CLOuD9 को सक्षम करने के लिए और अधिक व्यापक रूप से उपयोग किया जाएगा ।
सामूहिक रूप से, हम CLOuD9, एक अद्वितीय और मजबूत प्रौद्योगिकी है कि जबरन लेकिन reversibly लंबी दूरी के लक्ष्य जीनोमिक loci के बीच संपर्क बनाने के लिए कर सकते है विकसित किया है । क्रोमेटिन छोरों उत्प्रेरण के माध्यम से, हम यह भी है कि CLOuD9 उपयुक्त सेलुलर संदर्भ में जीन अभिव्यक्ति को संशोधित करने के लिए उपयोग किया जा सकता है प्रदर्शित करता है । प्रौद्योगिकी के अनुकूलन की अनुमति देता है किसी भी दो जीनोमिक loci के बीच बातचीत के अप्रतिबंधित अध्ययन के लिए, पाश क्षेत्रों या looping तंत्र के पूर्व ज्ञान की आवश्यकता के बिना । इसके अलावा, CLOuD9’s अनोखा प्रदर्शन किया reversibility रोग और विकास में पाश तंत्र के आगे परीक्षा में सक्षम बनाता है । जबकि क्रोमेटिन looping के पर लक्ष्य प्रभाव स्पष्ट रूप से प्रदर्शित किया गया है, वहां अभी तक के लिए रवाना लक्ष्य looping और पर लक्ष्य छोरों पर बाद के प्रभाव के प्रभाव में अंतर्दृष्टि की पेशकश डेटा हो रहा है ।
हमारे डेटा इस उपकरण के केवल कुछ अनुप्रयोगों को दिखाता है लेकिन प्रमुख अंतर्निहित विचार है कि क्रोमेटिन व्यवस्था जीन अभिव्यक्ति का संकेत है तात्पर्य है । हमारी प्रौद्योगिकी के अध्ययन और जीन विनियमन में क्रोमेटिन संरचना की बारीकियों का पता चलता है, जिससे जीन की प्रतिलेखन में क्रोमेटिन तह की भूमिका की समग्र समझ में सुधार किया जा सकता है । transcriptional गतिशीलता के बारीकियों की एक बेहतर समझ के अनुसंधान और कैंसर के उपचार में जिस तरह से नेतृत्व कर सकते हैं, वंशानुगत रोगों, और जन्मजात विकारों, जिसमें विशिष्ट क्रोमेटिन विधानसभा निस्संदेह बदल जीन अभिव्यक्ति20, 21,22,23. बाद काम CLOuD9 प्रौद्योगिकी का उपयोग व्यवस्था और क्रोमेटिन डोमेन की गतिशीलता और कैसे वे दोनों के विकास और रोग में स्थिर जीन अभिव्यक्ति को बनाए रखने के तह ड्राइव के बारे में अधिक जानकारी रोशन करेंगे ।
The authors have nothing to disclose.
हम एच चांग, टी ओरो, एस Tavazoie, आर फ्लिन, पी Batista, ई. Calo, और तकनीकी सहायता और पांडुलिपि के महत्वपूर्ण पढ़ने के लिए पूरे वैंग प्रयोगशाला धंयवाद । S.L.M. को NSFGRF (डीजीई-११४७४७), NDSEGF (FA9550-11-सी-0028), और राष्ट्रीय कैंसर संस्थान (1F99CA222541-01) के माध्यम से इस कार्य में सहयोग दिया गया है । K.C.W. बरोज वेलकम फंड से चिकित्सा वैज्ञानिकों के लिए एक कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित है, और एक डोनाल्ड ई. और डेलिया बी तीत फाउंडेशन संकाय विद्वान है ।
RPMI 1640 media | Life Technologies | 11875-119 | For K562 cell culture |
DMEM media | Life Technologies | 11995-065 | 1X, for 293T cell culture |
lentiCRISPR v2 | Addgene plasmid | #52961 | For CLOuD9 plasmid development |
pRSV-Rev | Addgene plasmid | #12253 | For lentivirus production |
pMD2.G | Addgene plasmid | #12259 | For lentivirus production |
pMDLg/pRRE | Addgene plasmid | #12251 | For lentivirus production |
Lipofectamine 2000 | Thermo Fisher Scientific | 11668-019 | For lentivirus production |
anti-HA antibody | Cell Signaling | 3724 | For immunoprecipitation |
anti-Flag antibody | Sigma | F1804 | For immunoprecipitation |
DNeasy Blood and Tissue Kit | Qiagen | 69504 | For DNA extraction |
TRIzol | Life Technologies | 15596-018 | For RNA extraction |
RNeasy Kit | Qiagen | 74106 | For RNA extraction |
Superscript VILO | Life Technologies | 11754-050 | For cDNA |
SYBR Green I MasterMix | Roche | 4707516001 | For qPCR analysis |
Light Cycler 480II | Roche | For qPCR analysis | |
anti-H3K4me3 antibody | AbCam | ab8580 | For ChIP-qPCR |
anti-RNA Pol-II antibody | Active Motif | 61083 | For ChIP-qPCR |
EDTA free protease inhibitor | Roche | 11873580001 | For protein extraction |
4-12% Tris Glycine gel | Biorad | Any size, For western blot | |
anti-Rabbit HRP antibody | Santa Cruz | sc-2030 | For western blot |
anti-mouse HRP antibody | Cell Signaling | 7076S | For western blot |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000AKU | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000APE | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | Encode | ENCSR000FCJ | For ChIP-seq analysis |
K562 and H3K293 ChIP-Seq data | GEO | GSM1479215 | For ChIP-seq analysis |
Dynabeads Protein A for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10001D | For immunoprecipitation |
Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation | Thermo Fisher Scientific | 10004D | For immunoprecipitation |
RNA Clean & Concentrator-5 | Zymo Research | R1015 | For RNA purification |
Pierce 16% Formaldehyde Methanol-free | Thermo Fisher Scientific | 28908 | For crosslinking |
PX458 Plasmid | Addgene | 48138 | Suggested active Cas9 plasmid for gRNA cloning, but any active Cas9 plasmid will do |
QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For PCR purification |
FastDigest BsmBI | Thermo Fisher Scientific | FD0454 | For cloning guide RNAs |
FastAP | Thermo Fisher Scientific | EF0651 | For cloning guide RNAs |
10X FastDigest Buffer | Thermo Fisher Scientific | B64 | For cloning guide RNAs |
QIAquick Gel Extraction Kit | Qiagen | 28704 | For cloning guide RNAs |
10X T4 Ligation Buffer | NEB | B0202S | For cloning guide RNAs |
T4 PNK | NEB | M0201S | For cloning guide RNAs |
2X Quick Ligase Buffer | NEB | B2200S | For cloning guide RNAs |
Quick Ligase | NEB | M2200S | For cloning guide RNAs |
Buffers | |||
Farnham lysis buffer | 1% Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS, 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA), and 1 mM EDTA in water | ||
Modified RIPA buffer | 1% NP40/Igepal, 0.5% sodium deoxycholate, 0.1% SDS, 1 mM EDTA, and 1% protease inhibitor water solution (non-EDTA) in PBS pH 7.8 or 7.4 | ||
IP dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton-X 100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris-HCl pH 8.0, 167 mM NaCl, 0.1x protease inhibitor | ||
Wash buffer | 100 mM Tris pH 9, 100 mM LiCl, 1% NP-40, and 1% sodium deoxycholate | ||
Swelling buffer | 0.1 M Tris pH 7.5, 10 mM potassium acetate, 15 mM magnesium acetate, 1% NP-40 | ||
Dilution buffer | 0.01% SDS, 1.1% Triton X-100, 1.2 mM EDTA, 16.7 mM Tris pH 8 and 167 mM NaCl | ||
IP elution buffer | 1% SDS, 10% NaHCO3 |