Descrevemos a detecção de ativação de inflammasome NLRP3 em bases celulares usando microscopia de fluorescência e mancha para ativa a caspase-1 e o adaptador, ASC. Um ensaio de liberação de lactato desidrogenase é apresentado para detectar pyroptotic lise em uma base de população. Estas técnicas podem ser adaptadas para estudar muitos aspectos da biologia de inflammasome.
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Artigo de método
Deteção de ativação de Inflammasome e morte celular de Pyroptotic nos macrófagos da medula óssea-derivado murino
Neste artigo
Resumo
Resumo
Inflammasomes são as plataformas sinalização imunes inatas que são necessários para o controle bem sucedido de muitos organismos patogénicos, mas também promovem inflamatória e doenças autoinflamatória. Inflammasomes são ativadas por receptores de reconhecimento padrão citosólica, incluindo membros da família do receptor (NLR) NOD-like. Estes receptores oligomerize na detecção de estímulos microbianas ou associada a danos. Recrutamento subsequente da proteína do adaptador ASC forma um complexo, de inflammasome microscopicamente visível que ativa a caspase-1 através da autoativação induzida por proximidade. Após a ativação, caspase-1 cliva pro-IL-1 β e pro-IL-18, levando à ativação e secreção dessas citocinas pró-inflamatórias. Caspase-1 também atua como mediador inflamatória forma de morte celular denominado pyroptosis, que apresenta a perda da lise de integridade e de célula de membrana. Caspase-1 fende gasdermin D, liberando o fragmento N-terminal que forma poros da membrana plasmática, levando a Lise osmótica.
In vitro, a ativação de caspase-1 pode ser determinado através da marcação de macrófagos derivados da medula óssea com a sonda de caspase-1 atividade FAM-YVAD-FMK e através da marcação das células com anticorpos contra a proteína do adaptador ASC. Esta técnica permite a identificação de inflammasome formação e ativação de caspase-1 em células individuais usando microscopia de fluorescência. Morte celular de Pyroptotic pode ser detectada medindo-se o lançamento do citosol lactato desidrogenase no meio de. Este procedimento é simples, custo-eficaz e realizado em um formato de placa de 96 poços, que permita a adaptação para a seleção. Neste manuscrito, mostramos que a ativação do inflammasome NLRP3 por nigericin leva à co localização da proteína do adaptador ASC e ativa a caspase-1, levando a pyroptosis.
Introdução
Inflamação mediada por Inflammasome é um componente crítico da defesa contra organismos patogénicos1, mas também está subjacente a etiologia de muitas doenças2. A resposta inflamatória a uma ampla gama de infecções é acionada através da detecção citosólica do patógeno associado padrões moleculares (PAMPs) ou danos associados a padrões moleculares (represas). Receptores de reconhecimento padrão (PRR), incluindo membros da família de NOD-like receptor (NLR), oligomerize na detecção destes PAMPs e represas. Isto provoca a formação de um complexo de proteína multi denominado o inflammasome, que contém o PRR, a adaptador da p....
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Protocolo
Todos os procedimentos de animais foram aprovados e conduzidos em Universidade das orientações do Comité de uso e cuidado Animal institucional do Washington.
1. colheita de medula óssea
- Assepticamente, remover o fêmur e tíbia de um rato e limpar os ossos usando instrumentos esterilizados. Coloque os ossos limpos em meio de Eagle modificado Dulbecco (DMEM) 5 mM HEPES + 0,2 mg/mL de L-glutamina + 0,05 mM 2-Mercaptoetanol + sulfato de gentamicina 50 mg/mL + 10.000 U/mL penicilina/estreptomicina + 10% soro fetal bovino (FBS, DMEM-10 completa) e incubar a tubo no gelo por 15 min.
- Remova as articulações proximal e distal da bo....
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Resultados
Para detectar a ativação de caspase-1 após a exposição de nigericin, as células foram processadas conforme descrito na seção de protocolo. Nós combinamos ambos FAM-YVAD-FMK e ASC anticorpo rotulando a fim de mostrar que ASC e ativa a caspase-1 co localizar após ativação mediada por NLRP3 inflammasome. Figura 1A mostra que o tipo selvagem macrófagos expostos a 5 μM nigericin têm formação de um foco ASC na região perinuclear. Estes focos contenham também ativa .......
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Discussão
Neste manuscrito, apresentamos duas técnicas para examinar a ativação de inflammasome e a consequência da ativação de caspase-1 após estimulação NLRP3 em macrófagos murino derivadas da medula óssea. A primeira técnica permite que o pesquisador determinar o nível de ativação de caspase-1 em uma base celular usando o repórter fluorescente FAM-YVAD-FMK. Este repórter é altamente específico para a vinculação da caspase-1 família de enzimas, como visto pela ausência de coloração em macrófagos deficientes de caspase-1/11. Espe.......
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Divulgações
Os autores têm sem conflitos de interesse a divulgar
Agradecimentos
Microscopia de todos foi feito no W. M. Keck microscopia Center com suporte de Nathaniel Peters e com apoio do prêmio NIH S10OD016240. S.L.F. é suportado pelo NIH K08AI119142 e R21AI130281. Agradecemos o Dr. Richard Flavell e o Dr. Brad Cookson para camundongos deficientes de caspase-1/11 e o Dr. Brad Cookson para a partilha de equipamentos e instalações laboratoriais.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| E-MEM | ATCC | 30-2003 | Para células L929 em crescimento |
| NCRC clone 929 (L929) | ATCC | CCL-1 | |
| Kit de Fixação/Permeabilização | BD Biosciences | 554714 | Inclui solução de fixação e permeabilização e tampão de lavagem. Formulações proprietárias. Contém 4,2% de formaldeído |
| Glicina | Biorad | 161-0718 | |
| Cytotox96 Ensaio de citotoxicidade não radioativa | Fisher Scientific | PR-G1780 | Inclui mistura de substrato e tampão de ensaio; Formulações proprietárias. A solução de parada é 1 M Ácido acético |
| FAM-YVAD-FMK | Immunocytochemistry Technologies | 98 | |
| DMEM, glicose alta, sem glutamina | Invitrogen | 11960044 | |
| DMEM, glicose alta, sem glutamina, sem vermelho de fenol | Invitrogen | 31053028 | |
| PBS de Dulbecco, sem cálcio, sem magnésio | Invitrogen | 14190144 | |
| Soro Bovino Fetal, qualificado, origem dos EUA | Invitrogen | 26140079 | Calor inativado a 55° C por 50 min |
| Gentamicin | Invitrogen | 15750060 | |
| ProLong Gold Mounting Medium | Invitrogen | p36934 | Formulação proprietária. Meio de montagem de cura. Endurece ao índice refratário de 1,46 |
| cabra anti-rato ALEXA555 | Invitrogen | A-21422 | |
| HEPES (Ultra Pure) | Invitrogen | 11344041 | |
| L-Glutamina | Invitrogen | 21051024 | |
| Penicilina-Estreptomicina | Invitrogen | 15140122 | |
| TO-PRO-3 Iodeto | Invitrogen | T3605 | fluorescente vermelho distante coloração de ácido nucleico |
| C57BL/6J camundongo | Jackson Laboratoy | 000664 | |
| caspase-1/11-/- camundongo | Jackson Laboratory | 016621 | |
| Leica SP8X Microscópio Confocal | Leica | ||
| Ultrapure LPS de Salmonella minnesota R595 (Re) | List Biologicals | 434 | |
| clone anti-ASC 2EI-7 | Millipore-Sigma | 04-417 | |
| beta-mercapto-etanol | Millipore-Sigma | M6250-10ML | |
| DMSO | Millipore-Sigma | D2650-5X10ML | |
| EDTA | Millipore-Sigma | E5391 | |
| Spectramax M3 leitor de placas | Molecular Devices | 5000414 |
Referências
- Jorgensen, I., Miao, E. A. Pyroptotic cell death defends against intracellular pathogens. Immunol Rev. 265 (1), 130-142 (2015).
- Guo, H., Callaway, J. B., Ting, J. P. Inflammasomes: mechanism of action, role in disease, and therapeutics. Nat Med. 21 (7), 677....
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Reimpressões e permissões
