Bu yazı basit yalıtım ve Yeni Zelanda beyaz tavşan synovial sıvı mezenkimal kök hücre arınma için basit ve ekonomik Protokolü sunar.
Mezenkimal kök hücre (MSCs) hücre tabanlı terapisi için ana hücre kaynaktır. MSCs eklem boşluğuna synovial sıvı üzerinden potansiyel olarak kıkırdak doku mühendisliği için kullanılabilir. MSCs sinovyal sıvının (SF-MSCs) üzerinden artiküler rejenerasyon için umut verici aday olarak kabul edilmiştir ve onların potansiyel terapötik yarar onları geç bir önemli araştırma konusu yaptı. SF-MSCs Yeni Zelanda beyaz tavşan diz boşluğuna üzerinden bir en iyi duruma getirilmiş translasyonel model olarak insan rejeneratif tıp değerlendirmek için istihdam edilebilir. (Mac) teknolojileri sıralama CD90 tabanlı manyetik aktif hücre, aracılığıyla bu iletişim kuralı başarıyla tavşan SF-MSCs (rbSF-MSCs) Bu tavşan modelinden elde eder ve daha fazla tam olarak MSC fenotip bu hücreler için ayırt etmek için onları ikna tarafından gösterir dokusunu, adipositler ve kondrosit. Bu nedenle, bu yaklaşım Biyoloji araştırma hücre ve doku mühendisliği basit ekipman ve yordamları kullanarak uygulanabilir.
MSCs kıkırdak lezyonlar için özellikle rejeneratif tıp için değerli bir kaynak olarak önerilmiştir. MSCs, kondrosit, dokusunu, adipositler, iskelet miyositler ve visseral stromal hücreler, dahil olmak üzere geniş alanlar için kök hücre transplantasyonu onların yüksek genişleme hızı ve çoklu soy farklılaşma potansiyel1nedeniyle genişletin. MSCs iskelet kas, synovium, kemik iliği ve yağ dokusu2,3,4ayrılmış olabilir. Bulgular confirmed Sinovyal sıvı MSCs varlığında da mevcuttur ve önceki araştırma synovial sıvı kaynaklı MSCs (SF-MSCs) eklem rejenerasyon5,6için umut verici aday olarak belirlemiştir.
Ancak, araştırma ve insan örnekleri üzerinde preklinik deneme tabi birçok etik sorunlar vardır. Bunun yerine, tavşan olan ve en sık hayvan türlerinin nakli MSCs kıkırdak hasarı onarabiliriz göstermek için kullanılan olmaya devam. Son yıllarda vivo içindebu hücreler çoğu insan için benzer MSCs onların Hücresel biyoloji ve doku fizyolojisi ve araştırmacılar giderek artan sayıda tavşan mezenkimal kök hücre (rbMSCs) her iki vitro inceledik. Benzer şekilde, rbMSCs plastik yüzeyler, iğ-fibroblast morfoloji olduğu gibi insan MSCs görüntüleme kalarak yeteneğine sahiptirler. Ayrıca, tavşan mezenkimal örnekleri basit ve kolay7elde etmek vardır. Ayrıca, en önemli makas are rbMSCs yüzey işaretleyicileri, CD44, CD90 ve CD105, gibi hızlı ve potansiyel çoklu soy farklılaşma, MSC nüfus tanımlaması için ölçüt ile anlaşma olduğu korunur Hücresel tedavi8,9için uluslararası toplum tarafından tanımlanan. Özellikle, Sinovyal sıvı chondroprogenitors ne zaman TGF-β1, böylece onları phenotypically eklem kıkırdak rejenerasyon10,11için uygun hücre kaynakları hale tarafından indüklenen hipertrofik sigara chondrogenesis yeteneğine sahiptirler, 12.
Ancak, SF-MSCs yalıtım göbek kordonu, yağ dokusu, periferik kan ve kemik iliği de dahil olmak üzere diğer dokulardan büyük ölçüde farklıdır. Akış Sitometresi yöntemi belirli ortam ve son derece pahalı aletler13gerektirse de, arıtma ve SF-MSCs sıralama için en yaygın bir yaklaşım akış sitometresi ve immunomagnetic boncuk tabanlı sıralama, şu anda.
Bu makale, beyaz tavşan Yeni Zelanda’dan synovial sıvı örnekleri basit ve minimal invaziv topluluğu için bir yordam sunar. Yordamı, boyunca rbSF MSCs stabil genişletilmiş vitro ve CD90 olumlu manyetik boncuk tabanlı yordamlara ile izole. Son olarak, protokol MSCs yüksek saflıkta ve canlılığı hasat hücre kaynaklarından elde etmek nasıl gösterir.
Bu protokol için temel morfolojisi, belirli işaretleri ve pluripotent kök hücreler için ifade izole rbSF MSCs karakterizedir. CD45 ve CD34 ifade negatif ise akış sitometresi tabanlı immunophenotyping CD44 ve CD105, önemli bir pozitif ifade ortaya koymaktadır. Son olarak, bir vitro tahlil rbSF-MSCs için bu hücreleri osteojenik, Adipojenik ve chondrogenic farklılaşma göstermektedir.
MSCs vâr synovial sıvı hücre tabanlı terapi için bir alternatif sağlar. Önceki çalışmalar yaralanma siteleri mezenkimal kök hücre olumlu sonrası yaralanma dönem5ile ilişkili onların synovial sıvı daha yüksek miktarda içerir göstermiştir. MSCs synovial sıvı doku sonra bir yaralanma18,19spontan iyileşme arttırmak için yararlı olabilir. Esas olarak tanımlanmamış20SF-MSCs eklemlerde mekan…
The authors have nothing to disclose.
Bu çalışmada aşağıdaki hibe tarafından mali destek verdi: Çin doğal Bilim Vakfı (No. 81572198; No 81772394); Fon için yüksek düzey tıbbi disiplin inşaat Shenzhen Üniversitesi (No. 2016031638); Guangdong Eyaleti, Çin (No Tıbbi Araştırma Vakfı A2016314); ve Shenzhen bilim ve teknoloji projeleri (No. JCYJ20170306092215436; No JCYJ20170412150609690; No JCYJ20170413161800287; No SGLH20161209105517753; No JCYJ20160301111338144).
Reagents | |||
MesenGro | StemRD | MGro-500 1703 | Warm in 37 °C water bath before use |
MesenGro Supplement | StemRD | MGro-500 M1512 | Component of MSCs culture medium |
DMEM basic | Gibco Inc. | C11995500BT | MSCs differentiation medium |
Isotonic saline solution | Litai, China | 5217080305 | Cavity arthrocentesis procedure reagent |
Phosphate-Buffered Saline (PBS) | HyClone Inc. | SH30256.01B | PBS, free of Ca2+/Mg2+ |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Gibco Inc. | 10099-141 | Component of MSCs culture medium |
Povidone iodine solution | Guangdong, China | 150605 | Sterilization agent |
75% ethanol | Lircon, china | 170917 | Sterilization agent |
0.25% Trypsin/EDTA | Gibco Inc. | 25200-056 | Cell dissociation reagent |
1% Penicillin-Streptomycin | Gibco Inc. | 15140-122 | Component of MSCs medium |
MACS Running Buffer | MiltenyiBiotec | 5160112089 | Containing phosphate-buffered saline (PBS), 0.5% bovine serum albumin(BSA), and 2 mMEDTA |
CD90 antibody conjugated MicroBeads | MiltenyiBiotec | 5160801456 | For magnetic activated cell sorting |
Sodium pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | Component of MSCs chondrogenic differentiation |
Dexamethasone | Sigma-Aldrich | D1756 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
ITS | BD | 354352 | 1%, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607 | 0.35 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
L-ascorbic acid-2-phosphate | Sigma-Aldrich | A8960 | 50 mM, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
3-isobutyl-1-methylxanthine | Sigma-Aldrich | I5879 | 0.5 mM, Component of adipogenic differentiation |
Indomethacin | Sigma-Aldrich | I7378 | 100 mM, Component of adipogenic differentiation |
TGFβ1 | Peprotech | 100-21 | 10 ng/mL, Component of MSCs chondrogenic differentiation |
α-glycerophsphate | Sigma-Aldrich | G6751 | Component of MSCs osteogenic differentiation |
CD34 Polyclonal Antibody, FITC Conjugated | Bioss | bs-0646R-FITC | Hematopoietic stem cells marker |
Mouse antirabbit CD44 | Bio-Rad | MCA806GA | Thy-1 membrane glycoprotein (MSCs marker) |
CD45 (Monoclonal Antibody) | Bio-Rad | MCA808GA | Hematopoietic stem cells marker |
CD105 antibody | Genetex | GTX11415 | MSCs marker |
Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | I9030 | Precipitates RNA extraction organic phases |
Trichloromethane | Wenge, China | 61553 | Extract total RNA |
Trizol | Invitrogen | 15596-018 | Isolate total RNA |
SYBR green master mix | Takara Bio, Japan | RR420A | PCR test |
cDNA synthesis kit | Takara Bio, Japan | RR047A | Reverse-transcribed to complementary DNA |
Alizarin Red | Sigma-Aldrich | A5533 | Staining of calcium compounds |
Toluidine Blue | Sigma-Aldrich | 89640 | Staining of cartilaginous tissue |
Oil Red O solution | Sigma-Aldrich | O1391L | Lipid vacuole staining |
Equipment | |||
MiniMACS Separator | MiltenyiBiotec | 130-042-102 | For magnetic activated cell sorting |
MultiStand | MiltenyiBiotec | 130-042-303 | For magnetic activated cell sorting |
MS Columns | MiltenyiBiotec | 130-042-201 | For magnetic activated cell sorting |
Cell Strainer | FALCON Inc. | 352340 | 40 μm nylon |
Hemocytometer | ISOLAB Inc. | 075.03.001 | Cell counting |
Falcon 100 mm dish | Corning | 353003 | Cell culture dish |
Microcentrifuge tube | Axygen | MCT-150-C | RNA Extraction and PCR |
Centrifuge Tubes | Sigma-Aldrich | 91050 | Gamma-sterilized |
High-speed centrifuge | Eppendorf | 5804R | Centrifuge cells |
Carbon dioxide cell incubator | Thermo scientific | 3111 | Cell culture |
Real-Time PCR Instrument | Life Tech | QuantStudio | Real-Time quantitative polymerase chain reaction |
Flow cytometer | BD Biosciences | 342975 | Cell analyzer |
Pipettor | Eppendorf | O25456F | Transfer the liquid |
Cloning cylinder | Sigma-Aldrich | C3983-50EA | Isolate and pick individual cell colonies |
Sterile hypodermic syringe | Double-Dove, China | 131010 | Arthrocentesis procedure |
Rabbit cage | Zhike, China | ZC-TGD | Restrain the rabbit |